بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران
متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :میکروبیولوژی
گرایش :عمومی
عنوان :بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران
دانشگاه آزاد اسلامی
واحد دامغان
دانشکده
پایان نامه (یا رساله) برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته میکروبیولوژی
گرایش عمومی
عنوان
بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران
استاد راهنما
سیده مرجان مجابی
بهمن ماه 1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1
فصل اول : مقدمه
1-1-بیان مسئله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………2
1-2-اهمیت و ضرورت تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………3
1-3-اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4
1-4-فرضیه های تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..4
1-5-تاریخچه اشرشیا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5
1-5-1-خانواده انتروباکتریاسه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5
1-5-2-اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….6
1-5-3-طبقه بندی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………6
1-5-3-1-ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………7
1-5-3-2-ساختار آنتی ژن سوماتیک یا آنتی ژن O…………………………………………………………………………………………………………………………………….7
1-5-3-3-ساختار آن کپسولی یا آنتی ژن K………………………………………………………………………………………………………………………………………………….8
1-5-3-4-ساختار آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن تاژکی یا آنتی ژن H………………………………………………………………………………………………………….9
1-5-3-5-ساختار آنتی ژن فیمبریه ای یا آنتی ژن F……………………………………………………………………………………………………………………………………9
1-6-خصوصیات مورفولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..10
1-6-1-خصوصیات کشت و بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………11
1-6-2-مقاومت……………………………………………………………………………………………………………………………… 
……………………………………………………………………12
1-6-3-ژنتیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13
1-7-بیماری زایی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13
1-7-1-فاکتورهای حدت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
1-7-1-1-کپسول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14
1-7-1-2-آندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………14
1-7-1-3-پروتئین های اتصالی فیمبریه ای………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
1-7-1-4-اگزوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15
1-7-2-1-انتروتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16
1-7-2-2-سیتوتوکسین ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..16
1-7-2-3-وروتوکسین ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………17
1-7-2-4-آلفاهمولیزین ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….17
1-7-2-5-سیدروفورها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17
عنوان صفحه
1-7-3-تغییر فاز آنتی ژنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18
1-7-3-1-سیستم ترشحی نوع III …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..18
1-7-3-2-بیماری در انسان…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………18
1-7-4-1-پاتوتیپ اشرشیا کلی های پاتوژن روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………19
1-7-4-2-پاتوتیپ اشرشیا کلی توکسین زای روده ای(ETEC)………………………………………………………………………………………………………………19
1-7-4-3-پاتوتیپ اشرشیا کلی بیماری زای روده ای (EPEC)………………………………………………………………………………………………………………20
1-7-4-4-پاتوتیپ اشرشیاکلی انترواگرگتیو(EAggEC)……………………………………………………………………………………………………………………………21
1-7-4-5-پاتوتیپ اشرشیا کلی انتروهموراژیک (EHEC)……………………………………………………………………………………………………………………….21
1-7-4-6-پاتوتیپاشرشیا کلی انترواینواسیو(EIEC)……………………………………………………………………………………………………………………………………..22
1-8-عفونت های اشرشیا کلی های خارج روده ای…………………………………………………………………………………………………………………………………….22
1-8-1-1-باکتریولوژی و مننژیت اشرشیا کلی (MAEC)………………………………………………………………………………………………………………………….23
1-8-1-2-سپسیس………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..23
1-8-1-3-التهاب مثانه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23
1-8-1-4-سپتی سمی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24
1-8-2-عفونت مجاریادراری(UTI)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….24
1-8-2-1-مقاومت های آنتی بیوتیکی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..25
1-8-2-2-مقاومت در اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26
1-8-2-3-فیلوژنتیک اشرشیا کلی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..26
1-9-عوامل بیماری زایی(ویرولانس در اشرشیا)……………………………………………………………………………………………………………………………………………27
1-9-1-ژن aer (آئروباکتین)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..28
1-9-1-2-اتصال دهنده ها (Adhesions)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….29
1-9-1-3-مکانیسم بیماری زاییUPEC در ارتباط با افمبریال ادهسین………………………………………………………………………………………………….30
1-9-1-5-مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با همولیزین (HlyA)……………………………………………………………………………………………..33
1-10-تعاریف واژه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..34
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1- بررسی تحقیقات انجام شده……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1-نوع مطالعه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
3-2-جامعه مورد مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………38
3-3-روش انجام طرح………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
3-3-1-مواد وتجهیزات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….38
3-3-1-1-دستگاه ها و وسایل مورد نیاز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..38
3-3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41
3-3-1-3-محیط های کشت مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..41
3-4-ترکیبات و محلول های مورد استفاده در تحقیق و فرمول ساخت آنها……………………………………………………………………………………………..41
3-5-روش اجرا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
3-5-1-جمع آوری اطلاعات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..43
3-5-2-انجام امور باکتریولوژیک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43
3-5-3-نمونه برداری، کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتری ها……………………………………………………………………………………………………………43
3-5-3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….43
3-5-3-2-طرز تهییه محیط های کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
3-5-3-3-نگه داری نمونه های عفونت ادراری………………………………………………………………………………………………………………………………………………45
3-5-3-4-نگه داری سویه باکتری………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
3-5-4-استخراج، تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………………….46
3-5-4-1-استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..46
3-5-4-2-کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده…………………………………………………………………………………………………………………..46
3-5-5-انجام آزمایشات مولکولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47
3-5-5-1-پرایمرها……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47
3-5-5-2-رقیق سازی پرایمرها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….49
3-5-6-انجام PCR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..49
3-5-6-1-بهینه سازی اجزاء واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..50
3-5-6-2-بهینه سازی تهیه Master Mix ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
3-5-7-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………50
3-5-7-1-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن HlyA…………………………………………………………………………………..51
3-5-7-2- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Pap ……………………………………………………………………………………..51
3-5-7-3- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Cnf ………………………………………………………………………………… 52
3-5-7-4- گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژن Afa ………………………………………………………………………………….. 53
3-5-7-5-گرادیانت دمایی جهت به دست آوردن دمای اتصال برای ژنFim ………………………………………………………………………………… 53
3-6-مراحل انجام PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-6-1-بهینه سازی PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-6-2-بررسی محصول PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
3-7-مواد مورد نیاز برای انجام الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..56
3-7-1-ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
3-7-1-1-طرز تهییه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….56
3-7-1-3-بافر سنگین کننده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
3-7-1-4-رنگ آمیزی ژل…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57
3-8-توالی یابی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………57
3-9-1-روش گردآوری اطلاعات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….57
3-9-2-روش تجزیه و تحلیل اطلاعات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….58
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1-فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59
4-2-نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی…………………………………………………………………………………………………………………..60
4-3-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن آئروباکتین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………………………………………………..61
4-3-1-بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….61
4-3-1-1-انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….62
4-3-2-نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن سایتوتوکسیک نکروز دهنده در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن………..64
4-3-2-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64
4-3-2-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..64
4-3-3- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن همولیزین در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………..65
4-3-3-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..65
4-4-4- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنP – فیمبریه در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن…………………………………………66
4-4-4-1- بهینه سازی دمای اتصال …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..66
4-4-4-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67
4-5-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژن Afaدر سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………..68
4-5-5-1- بهینه سازی دمای اتصال…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..68
4-5-5-2- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..69
4-6-6- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنFim در سویه های واجد اشرشیا کلی یوروپاتوژن……………………………………………………70
4-6-6-1- بهینه سازی دمای اتصال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….70
4-7-ژن های ویرولانس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72
4-8-نتایج ویرولوتایپینگ سویه ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
4-9-نتایج تایید محصولات PCR ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………79
فصل پنجم: نتیجه گیری
5-1-بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….91
5-2-مقایسه نتایج بدست آمده با یافته های دیگر محققین…………………………………………………………………………………………………………………………..91
5-3-نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….95
5-4- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..95
فهرست منابع
منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96
منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………97
چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..102زمون آ
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحه
جدول 1-1: ژن های ویرولانس در اشرشیا کلی و عملکرد ژن ها………………………………………………………………………………………………………………….30
جدول3-1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48
جدول 3-2: اجزاء و ترکیبات مورد استفاده برای واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………..49
جدول 3-3: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن aer ………………………………………………………………………………………………………………………………………….50
جدول 3-4: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن HlyA………………………………………………………………………………………………………………………………………51
جدول 3-5: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Pap ………………………………………………………………………………………………………………………………. 52
جدول 3-6: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Cnf ……………………………………………………………………………………………………………………………………..52 جدول 3-7: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Afa …………………………………………………………………………………………………………………………………………53
جدول 3-8: برنامه دمایی ترموسایکلر برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………………………………………..54
جدول 4-1: مشخصات ایزوله های اشرشیا کلی جدا شده از بیماران……………………………………………………………………………………………………………73
جدول 4-2: نتایج ویرولوتایپینگ درکل سویه ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………77
جدول4-3: نتایج ویرولوتایپینگ در سویه های اشرشیا کلی، سویه های مشابه در هر ژن……………………………………………………………………….78
فهرست علامت ها و اختصارها
معادل فارسی معادل انگلیسی علامت
اشرشیا کلی Escherichia coli E.coli
واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR Polymerase chain reaction
عفونت مجاری ادراری Infectios UTI Urinary Tract
اشرشیا کلی یوروپاتوژن UPEC Uropathogenic Escherichia coli
فهرست شکل ها و تصویر ها
عنوان شکل صفحه
شکل1-1: شکل شماتیک از ساختار آنتی ژنی اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………………………..10
شکل1-2: شکل شماتیک از نحوه اتصال باکتریE.coli به سطح سلول های اپیتلیال سطحی بدن………………………………………………………..31
شکل1-3: شکل شماتیک از فاکتورهای ویرولانس در اشرشیا کلی………………………………………………………………………………………………………………..33
شکل1-4: شکل شماتیک از مکانیسم بیماری زاییUPEC ……………………………………………………………………………………………………………………………….34
شکل 3-1: کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….47
شکل 4-1: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن aer……………………………………………………………………………………………………………62
شکل4-1-1: نتایج PCR به منظور تکثیر ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………….63
شکل4-1-2: نتایج PCR ژن aer در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………………63
شکل4-2: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Cnf ………………………………………………………………………………………………………….64
شکل4-2-1: نتایج PCR ژن Cnf در سایر ایزوله ها………………………………………………………………………………………………………………………………………….65
شکل4-3: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن HlyA ……………………………………………………………………………………………………..66
شکل4-4: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژنPap……………………………………………………………………………………………………………67
شکل4-4-1: نتایج PCR ژن Pap در سایر ایزوله ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………68
شکل 4-5: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Afa ……………………………………………………………………………………………………..69
شکل 4-5-1: نتایج PCR ژن Afa در سایر ایزوله ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..70
شکل4-6: گرادیانت دمایی جهت انتخاب دمای منایب برای ژن Fim………………………………………………………………………………………………………..71
شکل4-7: ژن های ویرولانس در کنار هم. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72
شکل4-8-1: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس aer…………………………………………………………………………..79
شکل4-8-2: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس HlyA……………………………………………………………………..81
شکل4-8-3: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Cnf…………………………………………………………………………83
شکل4-8-4: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Afa …………………………………………………………………………86
شکل4-8-5: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانس Fim…………………………………………………………………………..88
شکل4-8-6: نتایج حاصل از سکانسینگ برخی محصولات PCR ژن ویرولانسPap…………………………………………………………………………….89
فهرست نمودار ها
عنوان نمودار صفحه
نمودار4-1: فراوانی بیماران بر اساس جنس…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..59
نمودار4-2: فراوانی بیماران براساس سن (سال)…………………………………………………………………………………………………………………………………………..60
نمودار4-3: نتایج مربوط به فراوانی فاکتورهای حدت در اشرشیا کلی……………………………………………………………61
چکیده
زمینه و هدف: اشرشیا کلی یوروپاتوژن یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده عفونت مجاری ادراری است. این سویه ها انواع مختلفی از فاکتورهای ویرولانس از جمله چسبنده ها، توکسین ها، سیستم های اکتساب آهن را دارا می باشند. ژن های ویرولانس روی عناصر ژنتیکی متحرک و یا در نواحی خاصی از کروموزوم که جزایر پاتوژنیستی نامیده می شوند قرار دارند. هدف از این مطالعه بررسی وجود و تعیین هویت فاکتور های پاتوژنیسته در سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله(عج) تهران می باشد. مواد و روش ها: از 150 نمونه ی ادرار جمع آوری شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران مجموعه ای از 100 ایزوله ی اشرشیا کلی بین تیرماه تا دی ماه 1393 جدا گردید. باکتری اشرشیا کلی با بهره گرفتن از تکنیک های بیوشیمیایی و میکروب شناسی استاندارد شناسایی شد. استخراج ژنوم باکتری ها با بهره گرفتن از روش جوشاندن انجام گرفت و بررسی وجود و تعیین هویت فاکتورهای ویرولانس با بهره گرفتن از روش PCR انجام گرفت. نتایج: PCR به طور موفقیت آمیزی برای تمامی 6 ژن مورد نظر بهینه سازی شد و توانست باندهای مورد نظررا نشان دهند. عفونت مجاری ادراری ایجاد شده با اشرشیا کلی 83 % برآورد گردید شیوع ژن های ویرولانس به ترتیب شامل:(98%)( bp 328) Pap(95%)(bp 602) aer ،(94%)( bp 559) Fim،(86%)( bp 693)cnf ،(63%)( bp 750)Afa ، (62%)( bp 1177)hlyA به طور موفقیت آمیزی تکثیر یافتند. بحث: مطالعه حاضر نشان داد که شیوع ژن های ویرولانس pap ،aer ، Fimدر میان سویه های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران بالا می باشد و کمترین شیوع مربوط به ژن hlyA (همولیزین)می باشد.
کلمات کلیدی: اشرشیا کلی یوروپاتوژن، عفونت مجاری ادراری، ژن های ویرولانس، واکنش زنجیره ای پلیمراز
فصل اول
مقدمه
1-1-بیان مسئله
اشریشیا کلی(E.coli)1 یک باسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه است که به طور شایع در روده جانوران خونگرم و برخی پرندگان وجود دارد. انتقال این باکتری از طریق مسیر مدفوعی- دهانی از یک فرد به فرد دیگر و یا از طریق آب و غذای آلوده می باشد. اشریشیا کلی به خوبی روی محیط های معمولی رشد کرده و یک باکتری کم