وبلاگ

 اغفال مجنی علیه یکی دیگر از شرایط ضروری تحقق بزه کلاهبرداری است .

عدم رضایت صاحب مال در تمامی جرائم علیه اموال برای تحقق جرم لازم است . با این تفاوت که در کلاهبرداری مالباخته می بایست مال خود را با رضایت کامل که به ظاهر واقعی هم به نظر می رسد اما در حقیقت نتیجه فریفته شدنی باشد که ناشی از به کار بردن وسیله متقلبانه و مانورهای متقلبانه از جانب کلاهبردار است . در اختیار کلاهبردار قرار دهد . بدین معنا که هم باید بیان داشت که اغفال مجنی علیه یکی دیگر از شرایط ضروری تحقق بزه کلاهبرداری است که وسایل مورد استفاده کلاهبردار هم متقلبانه باشد و هم قربانی جرم باید عملاً فریب بخورد و در نتیجه اغفال ، مالش را با رضایت در اختیار کلاهبردار قرار دهد . در واقع (شرط اغفال مجنی علیه) شرطی مجزا از شرط لزوم متقلبانه بودن وسایل مورد استفاده کلاهبرداری می باشد . از این نظر که وسایل مورد استفاده توسط کلاهبردار باید « عرفاً متقلبانه » محسوب گردد و علاوه بر این قربانی جرم « عملاً » فریب خورده و مالش را با « رضایت » خود در اختیار کلاهبردار قرار دهد .

بنابراین کسی که با استفاده از داروی بیهوش کننده یا خواب آور دیگری را بیهوش کند و موجب زوال شعور و هوشیاری او می شود در نتیجه مالش را بر میدارد و می برد ، نمی توان به ارتکاب جرم کلاهبرداری محکوم کرد بلکه در صورت وجود سایر شرایط جرم سرقت اطلاق عنوان سرقت به عمل او مناسب تر به نظر می رسد زیرا در این گونه اقدامات فریفته شدن و اغفال مجنی علیه صورت نمی پذیرد تا مجنی علیه در اثر رضایت حاصل از آن فریب اموال خود را در اختیار مرتکب قرار دهد .

برای ارتکاب کلاهبرداری مرتکب باید از نبوغ و بهره هوشی بالایی برخوردار باشد ، ظرافت کار در این است که کلاهبردار چنان وانمود می نماید و صحنه سازی لازم را چنان فراهم می کند که حتی صاحب مال با تشکر و قدردانی از او مالش را در اختیار وی قرار می دهد و معمولاً کلاهبرداران به نحوی عمل می نمایند که در صورت احراز تخلفشان ، عملشان بیشتر منطبق بر تدلیس مدنی باشد تا بزه کلاهبرداری ، تدلیس کننده وقتی کلاهبردار است که عنصر معنوی جرم کلاهبرداری را داشته باشد والا عمل او فاقد جنبه جزایی است . بنابر آنچه بیان شد تا زمانی که مال باخته اغفال نشود و به طور طبیعی مالش را به کلاهبردار نمی دهد ، لازمه اغفال و فریب قربانی عدم آگاهی او نسبت به متقلبانه بودن وسایل مورد استفاده کلاهبردار می باشد در غیر اینصورت اغفال صورت نگرفته است و بزه کلاهبرداری تحقق پیدا نکرده است .

بدین ترتیب هر گاه خریدار زمین یا هر مبیع دیگر بداند که زمین یا مبیع را که فروشنده یا دلال به وی نشان می دهد همان زمین یا مبیع مورد معامله نیست بلکه نامرغوب تر از آن است ولی با این حال اقدام به انجام معامله کند ، حتی اگر در این معامله ضرر قابل ملاحظه ای هم نماید بعداً نمی تواند تقاضای تعقیب کیفری فروشنده یا دلال را تحت عنوان کلاهبردار داشته باشد زیرا او با آگاهی و علم به موضوع این معامله را انجام داده است ، این موضوع از نظر فقهی بر اساس قاعده اقدام قابل توجیه است . رویه قضایی هم در تایید این امر در رای شماره 73 مورخ 20/1/1336 شعبه دوم دیوان عالی کشور اشعار می دارد : « اگر چند مامور کشف جرم برای خرید دلار تقلبی از متهم به او مراجعه نمایند و نام برده دلارهای تقلبی را به آنها عرضه اغفال مجنی علیه یکی دیگر از شرایط ضروری تحقق بزه کلاهبرداری است . عدم رضایت صاحب مال در تمامی جرائم علیه اموال برای تحقق جرم لازم است . با این تفاوت که در کلاهبرداری مالباخته می بایست مال خود را با رضایت کامل که به ظاهر واقعی هم به نظر می رسد اما در حقیقت نتیجه فریفته شدنی باشد که ناشی از به کار بردن وسیله متقلبانه و مانورهای متقلبانه از جانب کلاهبردار است . در اختیار کلاهبردار قرار دهد . بدین معنا که هم باید بیان داشت که اغفال مجنی علیه یکی دیگر از شرایط ضروری تحقق بزه کلاهبرداری است که وسایل مورد استفاده کلاهبردار هم متقلبانه باشد و هم قربانی جرم باید عملاً فریب بخورد و در نتیجه اغفال ، مالش را با رضایت در اختیار کلاهبردار قرار دهد . در واقع (شرط اغفال مجنی علیه) شرطی مجزا از شرط لزوم متقلبانه بودن وسایل مورد استفاده کلاهبرداری می باشد . از این نظر که وسایل مورد استفاده توسط کلاهبردار باید « عرفاً متقلبانه » محسوب گردد و علاوه بر این قربانی جرم « عملاً » فریب خورده و مالش را با « رضایت » خود در اختیار کلاهبردار قرار دهد . بنابراین کسی که با استفاده از داروی بیهوش کننده یا خواب آور دیگری را بیهوش کند و موجب زوال شعور و هوشیاری او می شود در نتیجه مالش را بر میدارد و می برد ، نمی توان به ارتکاب جرم کلاهبرداری محکوم کرد بلکه در صورت وجود سایر شرایط جرم سرقت اطلاق عنوان سرقت به عمل او مناسب تر به نظر می رسد زیرا در این گونه اقدامات فریفته شدن و اغفال مجنی علیه صورت نمی پذیرد تا مجنی علیه در اثر رضایت حاصل از آن فریب اموال خود را در اختیار مرتکب قرار دهد . برای ارتکاب کلاهبرداری مرتکب باید از نبوغ و بهره هوشی بالایی برخوردار باشد ، ظرافت کار در این است که کلاهبردار چنان وانمود می نماید و صحنه سازی لازم را چنان فراهم می کند که حتی صاحب مال با تشکر و قدردانی از او مالش را در اختیار وی قرار می دهد و معمولاً کلاهبرداران به نحوی عمل می نمایند که در صورت احراز تخلفشان ، عملشان بیشتر منطبق بر تدلیس مدنی باشد تا بزه کلاهبرداری ، تدلیس کننده وقتی کلاهبردار است که عنصر معنوی جرم کلاهبرداری را داشته باشد والا عمل او فاقد جنبه جزایی است . بنابر آنچه بیان شد تا زمانی که مال باخته اغفال نشود و به طور طبیعی مالش را به کلاهبردار نمی دهد ، لازمه اغفال و فریب قربانی عدم آگاهی او نسبت به متقلبانه بودن وسایل مورد استفاده کلاهبردار می باشد در غیر اینصورت اغفال صورت نگرفته است و بزه کلاهبرداری تحقق پیدا نکرده است . بدین ترتیب هر گاه خریدار زمین یا هر مبیع دیگر بداند که زمین یا مبیع را که فروشنده یا دلال به وی نشان می دهد همان زمین یا مبیع مورد معامله نیست بلکه نامرغوب تر از آن است ولی با این حال اقدام به انجام معامله کند ، حتی اگر در این معامله ضرر قابل ملاحظه ای هم نماید بعداً نمی تواند تقاضای تعقیب کیفری فروشنده یا دلال را تحت عنوان کلاهبردار داشته باشد زیرا او با آگاهی و علم به موضوع این معامله را انجام داده است ، این موضوع از نظر فقهی بر اساس قاعده اقدام قابل توجیه است . رویه قضایی هم در تایید این امر در رای شماره 73 مورخ 20/1/1336 شعبه دوم دیوان عالی کشور اشعار می دارد : « اگر چند مامور کشف جرم برای خرید دلار تقلبی از متهم به او مراجعه نمایند و نام برده دلارهای تقلبی را به آنها عرضه نماید این عمل شروع به کلاهبرداری نیست زیرا لازمه شروع به کلاهبرداری عدم وقوف طرف بر قصد و منظور مرتکب از توسل به وسایل متقلبانه است .» در این مثال خواست مامورین از همان ابتدا به دست آوردن دلارهای تقلبی بوده که تحقق یافته است و در اصل به همین منظور نزد فروشنده دلارهای تقلبی رفته اند و به تقلبی بودن دلارها هم علم داشته اند بنابراین اصلاً اغفالی صورت نگرفته و مامورین فریفته نشده اند لذا دارنده دلارهای تقلبی مرتکب کلاهبرداری نشده است و اتهام وی در صورت تحقق شرایط دیگر به اتهام سایر جرائم موضوع قانون مجازات اسلامی تحت عناوین دیگری از جمله جعل و ترویج سکه تقلبی قابل بررسی و مجازات است . بنابراین جهل مالباخته و عدم آگاهی او نسبت به متقلبانه بودن وسایل متقلبانه که از نحوه به کار بردن وسایل متقلبانه (مانورهای متقلبانه ) توسط کلاهبردار متاثر می شود به صورت اغفال نماید این عمل شروع به کلاهبرداری نیست زیرا لازمه شروع به کلاهبرداری عدم وقوف طرف بر قصد و منظور مرتکب از توسل به وسایل متقلبانه است .»

در این مثال خواست مامورین از همان ابتدا به دست آوردن دلارهای تقلبی بوده که تحقق یافته است و در اصل به همین منظور نزد فروشنده دلارهای تقلبی رفته اند و به تقلبی بودن دلارها هم علم داشته اند بنابراین اصلاً اغفالی صورت نگرفته و مامورین فریفته نشده اند لذا دارنده دلارهای تقلبی مرتکب کلاهبرداری نشده است و اتهام وی در صورت تحقق شرایط دیگر به اتهام سایر جرائم موضوع قانون مجازات اسلامی تحت عناوین دیگری از جمله جعل و ترویج سکه تقلبی قابل بررسی و مجازات است .

بنابراین جهل مالباخته و عدم آگاهی او نسبت به متقلبانه بودن وسایل متقلبانه که از نحوه به کار بردن وسایل متقلبانه (مانورهای متقلبانه ) توسط کلاهبردار متاثر می شود به صورت اغفال 

1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک…………………………………………… 2
1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها……………………………… 5
1-1-2- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک…………………………………….. 7
1-1-3- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک……………………………. 7
1-1-4- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک…………………………………. 8
1-2-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیستی……………………………. 8
1-2-1- کشف ترکیبات فعال زیستی………………………………… 9
1-2-2- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت…………….. 9
1-3- روش‌های نوین کشف دارو……………………………………… 10
1-3-1- منابع برای داروهای جدید…………………………………… 10
1-3-2- روند کنونی کشف دارو……………………………………… 10
1-3-3- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید…………11
1-3-4- استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………..14
1-4- علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی…..14
1-5- اکتینومیست‌ها………………………………………………… 14
1-5-1- ویژگی‌ اکتینومیست‌ها……………………………………. 15
1-5-2- مورفولوژی اکتینومیست‌ها……………………………….. 16
1-5-3- فیزیولوژی اکتینومیست‌ها………………………………… 17
1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها…………………………………… 18
1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها ………………………………19
1-5-6- متابولیت‌های ثانویه……………………………………….. 20
1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال…………… 21
1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست…..23
1-5-8- اهمیت استرپتومیسس‌ها………………………………. 24
1-5-9- اکتینومیست‌های دریایی……………………………….. 25
1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی….27
1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید……28
1-6- اهداف پژوهش………………………………………………….29
2- مواد و روش‌ها……………………………………………………. 32
2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات………………………………………….32
2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز ……………………………………33
2-3- جمع‌آوری نمونه………………………………………………. 36
2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها………………………..37
2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها…………….38
2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی……………………..38
2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت………………………………………… 38
2-6-2- روش نگهداری بلند مدت…………………………………… 38
2-7- شناسایی باکتری‌ها ………………………………………….39
2-7-1- بررسی مورفولوژی………………………………………….39
2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم…………..39
2-7-3-تولید پیگمان محلول………………………………………….40
2-81-1- تاریخچه آنتی بیوتیک…………………………………………… 2 1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها……………………………… 5 1-1-2- ژنتیک تولید آنتی بیوتیک…………………………………….. 7 1-1-3- عوامل موثر بر تولید آنتی بیوتیک……………………………. 7 1-1-4- ویژگی‌های یک آنتی‌بیوتیک…………………………………. 8 1-2-نیاز به کشف ترکیبات فعال زیستی……………………………. 8 1-2-1- کشف ترکیبات فعال زیستی………………………………… 9 1-2-2- محدودیت های کشف ترکیبات فعال از طبیعت…………….. 9 1-3- روش‌های نوین کشف دارو……………………………………… 10 1-3-1- منابع برای داروهای جدید…………………………………… 10 1-3-2- روند کنونی کشف دارو……………………………………… 10 1-3-3- مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و نیاز به داروهای جدید…………11 1-3-4- استفاده توام از آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………..14 1-4- علت انتخاب میکروارگانیسم‌ها برای کشف ترکیبات فعال زیستی…..14 1-5- اکتینومیست‌ها………………………………………………… 14 1-5-1- ویژگی‌ اکتینومیست‌ها……………………………………. 15 1-5-2- مورفولوژی اکتینومیست‌ها……………………………….. 16 1-5-3- فیزیولوژی اکتینومیست‌ها………………………………… 17 1-5-4- اکولوژی اکتینومیست‌ها…………………………………… 18 1-5- 5- طبقه بندی اکتینومیست‌ها ………………………………19 1-5-6- متابولیت‌های ثانویه……………………………………….. 20 1-5- 7- اکتینومیست‌های تولید کننده ترکیبات فعال…………… 21 1-5-8- تنوع شیمیایی ترکیبات تولید شده توسط اکتینومیست…..23 1-5-8- اهمیت استرپتومیسس‌ها………………………………. 24 1-5-9- اکتینومیست‌های دریایی……………………………….. 25 1-5-10-متابولیت‌های ضد قارچی و اهمیت اکتینومیست‌های دریایی….27 1-5- 11- اکتینومیست‌های دریایی، منبعی برای کشف داروی جدید……28 1-6- اهداف پژوهش………………………………………………….29 2- مواد و روش‌ها……………………………………………………. 32 2-1- دستگاه‌ها و تجهیزات………………………………………….32 2-2- محلول‎ها و مواد مورد نیاز ……………………………………33 2-3- جمع‌آوری نمونه………………………………………………. 36 2-4- غنی‌سازی و کشت اکتینومیست‌ها………………………..37 2-5- جداسازی و تهیه کشت خالص اکتینومیست‌ها…………….38 2-6- حفظ و نگهداری ذخایر کشت باکتریایی……………………..38 2-6-1- نگهداری کوتاه‌مدت………………………………………… 38 2-6-2- روش نگهداری بلند مدت…………………………………… 38 2-7- شناسایی باکتری‌ها ………………………………………….39 2-7-1- بررسی مورفولوژی………………………………………….39 2-7-2- بررسی مورفولوژی باکتریایی و رنگ‌آمیزی گرم…………..39 2-7-3-تولید پیگمان محلول………………………………………….40 2-8-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی….40 2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست……….41 2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی…..41 2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال…………..41 2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال……………. 42 2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک…..43 2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین….43 2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال ……………….44 2-13- استخراج نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر ………………..44 2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد……………………………..45 2-15- تکثیر ژن rDNA 16S ………………………………………… 2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:…………………… 2-16- تخلیص محصول PCR……………………………………….. 2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA………………………….. 2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:…………………………….. 2-17-2- انجام BLAST……………………………………………… 2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA…………………… 3- نتایج………………………………………………………………. 50 3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها……………………………………. 50 3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال…………….. 52 3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا….55 3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال…………………..56 3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک….58 3-6- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)….59 3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها……………………………………….. 61 3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها……………… 61 3-9-تولید پیگمان محلول……………………………………………….65 3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز……………..66 3-11- تکثیر ژن 16s rDNA جدایه‌های فعال…………………………..67 3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA 4- بحث و پیشنهادات………………………………………………….. 73 4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی………………………….. 75 4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال……………………….. 75 4-3- استخراج متابولیت‌ها…………………………………………….. 76 4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال…………………….. 76 4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین…77 4-6- مورفولوژی کلنی‌ها………………………………………………. 78 4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA……………………………………….. 4-8- جمع بندی ………………………………………………………… 79 4-9-پیشنهادات …………………………………………………………..81 چکیده: اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با استفاده از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد. فصل اول: مقدمه 1- مقدمه 1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه [1]برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ[3] ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز[5] اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت. آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور[8] و رابرت کخ[9] باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند. اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک[10] در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس[11] در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم[12] شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد. در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین[16] در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین[18] در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس[19]، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004). استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن[20]،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003). 1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال[1] که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک[2] که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند. 1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یك لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیك بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها. 2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین). 3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند. 4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یك غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یك غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول،-غربالگری اولیه اکتینومیست های دارای فعالیت ضد باکتریایی….40
2-9- استخراج عصاره خام جدایه‌های فعال اکتینومیست……….41
2-10-غربالگری ثانویه برای یافتن متابولیت‌های ضد میکروبی…..41
2-10-1-بررسی فعالیت ضد باکتریایی سویه‌های فعال…………..41
2-10-2-بررسی فعالیت ضد قارچی سویه‌های فعال……………. 42
2-10-3-فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک…..43
2-10-4- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین….43
2-12-بررسی فعالیت اگزوآنزیمی سویه‌های فعال ……………….44
2-13- استخراج نوکلئیک اسید به روش بیدبیتر ………………..44
2-14- الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد……………………………..45
2-15- تکثیر ژن rDNA 16S …………………………………………
2-15-1- برنامه PCR برای ژن‌های 16S rDNA:……………………
2-16- تخلیص محصول PCR………………………………………..
2-17- بررسی مولکولی ژن 16S rDNA…………………………..
2-17-1- تعیین توالی ژن 16S rDNA:……………………………..
2-17-2- انجام BLAST………………………………………………
2-17-3- رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA……………………
3- نتایج………………………………………………………………. 50
3-1- جداسازی اکتینومیست‌ها……………………………………. 50
3-2- غربالگری اولیه جهت شناخت جدایه‌های فعال…………….. 52
3-3- غربالگری ثانویه جدایه‌های فعال علیه باکتری‌های بیماریزا….55
3-4- بررسی فعالیت ضد قارچی جدایه‌های فعال…………………..56
3-5- فعالیت سینرژیسمی عصاره خام اکتینومیست‌ها با آنتی بیوتیک….58
3-6- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)….59
3-7- فعالیت آنزیمی جدایه‌ها……………………………………….. 61
3-8- مورفولوژی اسپور کلنی و رنگ آمیزی جدایه‌ها……………… 61
3-9-تولید پیگمان محلول……………………………………………….65
3-10- استخراج نوکلئیک اسید و آنالیز آن با الکتروفورز……………..66
3-11- تکثیر ژن 16s rDNA جدایه‌های فعال…………………………..67
3-11-1- شناسایی مولکولی جدایه‌ها و رسم درخت فیلوژنی ژن 16S rDNA
4- بحث و پیشنهادات………………………………………………….. 73
4-1- جداسازی اکتینومیست‌های دریایی………………………….. 75
4-2- غربالگری سویه‌های اکتینومیست فعال……………………….. 75
4-3- استخراج متابولیت‌ها…………………………………………….. 76
4-4-غربالگری ثانویه عصاره خام جدایه‌های فعال…………………….. 76
4-5- فعالیت عصاره خام اکتینومیست‌ها علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین…77
4-6- مورفولوژی کلنی‌ها………………………………………………. 78
4-7- بررسی توالی‌ 16S rDNA………………………………………..
4-8- جمع بندی ………………………………………………………… 79
4-9-پیشنهادات …………………………………………………………..81
چکیده:
اکتینومیست‌ها همواره به عنوان یک منبع اصلی تولید کننده آنتی‌بیوتیک‌های جدید و متابولیت‌های ثانویه متنوع، در داروسازی مورد توجه بوده‌ است. هدف از این تحقیق جداسازی اکتینومیست‌های تولیدکننده متابولیت‌های فعال از رسوبات بستر دریای مازندران و بررسی پتانسیل تولید متابولیت‌های ضدباکتریایی، ضد قارچی و آنزیمی توسط این ارگانیسم‌ها می‌باشد. رسوبات دریای مازندران از اعماق 5 و 10 متر جمع‌آوری شد. نمونه‌ها رقیق شده و برای جداسازی اکتینومیست‌ها در محیط کشت انتخابی استارچ کازئین آگار (SCA) کشت داده شد. جدایه‌ها توسط روش‌های مورفولوژی و میکروسکوپی کلنی‌ها، شناسایی و جداسازی شدند. غربالگری اولیه جهت یافتن جدایه‌های فعال با روش Cross streak انجام شد. متابولیت‌های تولید شده توسط جدایه‌های فعال، استخراج شد و بررسی فعالیت این عصاره خام علیه باکتری‌ها و قارچ‌های بیماریزا و باکتری‌های مقاوم به آنتی بیوتیک با استفاده از روش انتشار در دیسک بررسی شد. از رسوبات دریا، تعداد 80 جدایه اکتینومیست جداسازی و شناسایی شد. در غربالگری اولیه 7 جدایه دارای بهترین فعالیت ضدباکتریایی به عنوان اکتینومیست‌ فعال بررسی شدند. نتایج مرحله دوم غربالگری نشان داد که جدایه‌های فعال جداشده، فعالیت ضد قارچی خوب علیه گونه‌های کاندیدا و آسپرژیلوس داشتند. نتایج نشان داد که جدایه‌های MN39، MN2 و MN3 فعالیت ضد قارچی بیشتری نسبت به بقیه جدایه‌ها نشان دادند. همچنین سویه‌های MN2(16±1.4) و (18±1.4) MN39 دارای فعالیت بهتری نسبت به آنتی‌بیوتیک وانکومایسین (14±1.4) علیه استافیلوکوکوس‌ اورئوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA) نشان دادند. بررسی توالی ژن 16S rDNA سویه‌های فعال و رسم درخت فیلوژنی آن‌ها نشان داد که 7 جدایه فعال متعلق به جنسsp. Streptomyces می‌باشند. در این تحقیق به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی میکروارگانیسم‌های بومی ایران، برای اولین‌ بار از رسوبات بستر دریای مازندران، اکتینومیست‌ها جداسازی و مطالعه شدند. نتایج نشان داد که رسوبات بستر دریای مازندران می‌تواند به ‌عنوان منبع غنی از اکتینومیست‌های فعال که توانایی تولید متابولیت‌های ضد میکروبی جدید را دارند، مورد مطالعه دقیق‌تری قرار گیرد. بنابراین با خالص‌سازی و مطالعه دقیق‌تر متابولیت‌های فعال اکتینومیست‌های رسوبات بستر دریای مازندران، بتوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید و مناسب برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌های مقاوم، معرفی کرد.
فصل اول: مقدمه
1- مقدمه
1-1- تاریخچه آنتی بیوتیک
مدت‌ها قبل از کشف پنی‌سیلین بشر آموخته بود به‌طور تجربی بعضی مواد خام را به عنوان عامل ضد میکروب مورد استفاده قرار دهد. ۶۰۰ – ۵۰۰ سال قبل از میلاد، چینی‌ها شیره کپک زده لوبیای شور را برای درمان عفونت‌ها بکار می‌بردند. در گذشته از عصاره گیاهانی مثل درمنه [1]برای مقابله با کرم آسکاریس، از پوست درخت سینچونا[2] برای درمان مالاریا و از ریشه گیاه اپیکا در درمان اسهال استفاده می‌کردند اما مصرف دوز بیش از حد آنها عوارضی همچون سمیت، اختلالات شنوایی و بینایی داشت. از فلزات سنگین نیز در درمان بیماری‌ها استفاده می‌شد. از جیوه در درمان سفلیس و آرسنیک در درمان بیماری انگل تریپانوزوما استفاده می‌شد که به‌دلیل سمیت بالای این ترکیبات درمان را با مشکل مواجه می‌کرد. در سال 1910 پائول ارلیخ[3] ترکیبات شیمیایی مختلف را به عنوان مواد ضد میکروبی آزمایش کرد و پایه گذار شیمی درمانی مدرن بود. او ارسفانآمین[4] را به عنوان اولین داروی موثر برای سفلیس معرفی کرد. کلمه آنتی بیوتیک از اصطلاح آنتی بیوز[5] اولین بار در سال ۱۸۸۹ به‌وسیله ویلمین[6] برای توجیه ماهیت رقابتی جوامع بیولوژیک که در آن فقط قویترین و اصلح‌ترین زنده می‌ماند بکار برده شد و چند سال بعد این اصطلاح برای آنتاگونیسم[7] میکروارگانیسم‌ها نیز مورد استفاده قرار گرفت.
آنتی بیوتیک‌ها مواد شیمیایی هستند که از میکروارگانیسم‌هایی مانند قارچ‌های میکروسکوپی و باکتری‌ها گرفته می‌شوند و از ادامه زندگی سلول‌های یوکاریوتی یا پروکاریوتی جلوگیری نموده و یا مانع تکثیر آنها می‌شوند در قرن 19 آقای لوئی پاستور[8] و رابرت کخ[9] باکتری‌ها را به عنوان عوامل بیماری معرفی کردند و کنترل آنهارا امری ضروری دانستند. تا قرن بیستم، داروهای نسبتا اندکی وجود داشت. در سال‌های اول قرن بیستم، پژوهشگران امور پزشکی امیدوار بودند که بتوانند با کشف یا ساخت داروهای جدید عامل عفونت را در داخل بدن از بین ببرند.
اولین کشف مهم در این زمینه بوسیله پزشک اسکاتلندی، الکساندر فلمینک[10] در سال 1928 میلادی انجام گرفت. در تابستان سال 1928 فلمینگ مشغول تحقیق درباره آنفلوانزا بود. ضمن انجام كارهای معمول آزمایشگاهی كه می‌بایست كشت‌های باكتریایی را كه در ظرف‌های پهن در پوش‌دار رشد كرده بودند زیر میكروسكوپ بررسی كند، متوجه شد كه در یكی از ظرف‌ها ناحیه شفافی به وجود آمده است. تحقیقات بیشتر نشان داد كه ناحیه شفاف در اطراف نقطه‌ای بود كه وقتی سرپوش ظرف گذاشته نشده بود، تكه‌ای كپك به درون آن افتاده بود. فلمینگ با به خاطر آوردن تجربیاتش در زمینه لیزوزیم، نتیجه گرفت كه كپك چیزی تولید می‌كند كه باعث مرگ باكتری‌های استافیلوكوكوس[11] در ظرف كشت شده بود. فلمینگ كپك را جدا كرد و آن را به عنوان یكی از اعضای جنس پنی‌سیلیوم[12] شناخت، و ماده آنتی بیوتیكی را كه تولید می‌كرد پنی‌سیلین نامید. فلمینگ در ادامه نشان داد كه پنی‌سیلین برای جانوران سمی نیست و به یاخته‌های بدن آسیبی نمی‌رساند. به سبب ضرورت بهره‌گیری سریع از توانایی پنی‌سیلین در مقابله با بیماری‌ها و درمان زخم‌های نظامیان جنگ جهانی دوم، تولید آن در مقیاس گسترده، هم در انگلستان و هم در ایالات متحده، از اولویت‌های اول بود. استفاده از پنی‌سیلین نه تنها جان هزاران نفر را طی جنگ جهانی نجات داد، بلكه عاملی شد تا برای كشف آنتی بیوتیك‌های دیگر، از جمله خانواده‌ای از تركیبات مشابه شیمیایی پنی‌سیلین به نام سفالوسپورین‌ها، پژوهش‌هایی انجام گیرد.
در سال 1945 جایزه نوبل در پزشكی به طور مشترك به او و فلوری[13] و چاین[14] داده شد (Clardy, 2009). با معرفی آنتی بیوتیک پنی‌سیلین به عنوان یک متابولیت ثانویه از کپک پنی‌سلیوم نوتاتوم[15] به دست آمد، دوران مدرن شیمی درمانی در سال 1940برای درمان بیماری‌های عفونی در انسان آغاز شد (Ligon, 2004). با کشف آنتی‌بیوتیک گرامایسیدین[16] در سال 1939 به عنوان اولین عامل باکتری‌کش از یک باکتری جداشده شده از خاک (باسیلوس برویس[17]) نقطه آغاز جداسازی و غربالگری باکتری‌ها و قارچ‌های خاک برای دستیابی به آنتی بیوتیک‌های جدید آغازشد (Dubos, 1993) کشف آنتی‌بیوتیک استرپتومایسین[18] در سال 1943 از باکتری استرپتومایسس[19]، باکتری‌ها را درکانون توجه عموم برای کشف داروهای جدید قرار داد (Riedlinger, 2004). استرپتومایسین اولین ترکیب از مجموعه متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی بود که از اعضای جنس استرپتومایسس به دست ‌آمد و به عنوان آغاز مسیر تولید آنتی‌بیوتیک از سایر باکتری‌ها معرفی می‌شود (Berdy, 2005). در حالی که تعریف اصلی از آنتی بیوتیک‌ها که توسط میکروبیولوژیست خاک واکسمن[20]،کاشف استرپتومایسین، به شدت متکی بر متابولیت‌های مولکولی تولید شده توسط میکروارگانیسم‌هایی بود که باعث مهار رشد و یا از بین بردن میکروارگانیسم‌های دیگر می‌شد بود ولی امروزه این اصطلاح همچنین شامل عوامل به دست آمده از سایر منابع طبیعی و یا ترکیبات با منشاء نیمه سنتتیک یا مصنوعی نیز گفته می‌شود (Laskin, 2003).
1-1-1- مکانیسم عمل آنتی بیوتیک‌ها
بیشتر آنتی بیوتیک‌ها بر روی هر دو نوع سلول پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها اثر می‌گذارند و به همین دلیل نمی‌توان همه آنها را از نظر درمانی برای انسان مورد استفاده قرار داد. آنتی‌بیوتیک‌ها به دو گروه عمده‌ی عوامل کشنده یا سیدال[1] که تمام سلول ها را می کشند و عوامل استاتیک[2] که رشد باکتری را مهار می‌کنند طبقه بندی می‌شوند. در جدول شماره 1-1 مهمترین دارو‌های ضد میکروبی و مکانیسم اثر آن‌ها را نشان می‌دهد. آنتی بیوتیک‌ها از طریق چهار مکانیسم کلّی ویژگی باکتریوسیدی یا باکتریواستاتیکی خود را بروز می‌دهند.
1-1-1-1- جلوگیری از سنتز دیواره سلولی باکتری: باكتری‌ها یك لایه خارجی سخت دارند كه دیواره سلولی آنها است و شكل میكروارگانیسم را تعیین می‌كند و از سلول باكتری كه فشار اسموتیك بالایی دارد محافظت می‌نماید . آسیب به دیواره سلولی (توسط لیزوزیم) یا مهار تولید آن ، به متلاشی شدن سلول می‌انجامد. آنتی‌بیوتیک‌هایی که باعث مهار سنتز دیواره ی سلولی می شوند عبارتند از: پنی‌سیلین‌ها (پنی‌سیلین G، پنی سیلین V، آمپی سیلین، نفسیلین، تیکارسیلین،کاربنی‌سیلین، کلوکاسیلین)، سفالوسپورین‌ها، باسیتراسین، وانکومایسین، سیکلوسرین، نووبیوسین، تیکوپلانین، ریستوستین، فوزومیوسین و فسفونوپپتیدها.
2-1-1-1- مهار پروتئین سازی: آنتی بیوتیک‌های این گروه را می توان در دو گروه ممانعت کننده از نسخه برداری و ممانعت کننده از ترجمه تقسیم بندی کرد. گروه اول شامل اکتینومایسین که با اتصال به مولکول DNA مانع سنتز mRNA می شود و ریفامپین که با اتصال به آنزیم RNA پلی مراز مانع سنتز mRNA می‌شود. گروه دوم شامل آنتی‌بیوتیک‌های مهارکننده جزء30S ریبوزوم(آمینوگلیکوزیدها، آمینو سایکلیتول‌ها، تتراسایکلین ها) و آنتی بیوتیک‌های مهار کننده جزء 50Sریبوزوم(ماکرولیدها، لینکومایسین‌ها و تتراسایکلین).
3-1-1-1- جلوگیری از سنتز اسید نوکلئیک: این گروه شامل میتومایسن( به دو زنجیره مکمل DNA متصل شده و مانع جدا شدن و همانندسازی آن می‌شود)، اکتینومایسین ( به مولکول DNA متصل شده و مانع سنتز مولکول mRNA می‌شود)، ریفامپین (به آنزیم RNA پلی مراز متصل شده و مانع سنتز mRNA می‌شود)، کینولون‌ها (نالیدیکسیک اسید؛ سینوکساسین و مشتقات فلورینه آن شامل نورفلوکساسین، سیپروفلوکساسین) می‌باشند.
4-1-1-1- تغییر در عملکرد غشاء سلولی: سیتوپلاسم تمام سلول‌های زنده توسط یك غشای سیتوپلاسمی محصور شده كه به‌عنوان یك غشای دارای نفوذپذیری انتخابی عمل می‌كند . این دسته با ایجاد تغییراتی در غشاء سلولی باعث افزایش نفوذپذیری و در نتیجه تخریب غشاء می‌شوند. نمونه این مكانیسم اثر پلی‌میكسین‌ها به طور مستقیم بر فسفاتیدیل اتانول آمین غشا در باكتری‌های گرم منفی می‌باشد و پلی ان‌ها که بر قارچ‌ها موثر هستند از دیگر داروهایی كه با مهار عمل غشای سلولی اثر می‌گذارند می‌توان به آمفوتریسین ب ، كلیستین، کلوتریمازول، کتوکونازول،

های برترقبل از انجام آزمایشات مزرعه ای مورد ارزیابی قرار گیرد و ارتباط بین هتروزیس و فاصله ژنتیكی بر اساس ماركرهای  مولکولی ISSRارزیابی گردد.همچنین ترکیب پذیری عمومی و خصوصی والدین و نحوه کنترل ژنتیکی صفات مورد بررسی قرار گرفت . میزان GCA وSCA برای تمامی صفات معنی دار و مثبت بود که نشان از اثرات توام افزایشی و غیر افزایشی در کنترل این صفات دارد. نتایج حاصل از آنالیز نشان داد که تمام صفت بیشتر تحت کنترل اثرات فوق غالبیت قرار دارند. تلاقی P1*P2 بیشترین ترکیب پذیری خصوصی برای صفت عملکرد و تعدادطبق در بوته را داشتند. بیشترین میزان هتروزیس برای صفت  ارتفاع تا اولین شاخه فرعی (83/0-) بود.بیشترین همبستگی بین میزان هتروزیس و فاصله ژنتیکی بر اساس مارکر های مولکولی ISSR مربوط به صفت عملکرد ( **30 r= )می باشدکه همبستگی قابل قبولی برای این صفت می باشد، اما برای سایر صفات همبستگی معنی داری مشاهده نشد.

کلید واژها: گلرنگ،هتروزیس، نشانگر ISSR، دای آلل.

فهرست مطالب

 1     فصل اول    1

2    فصل دوم   7

2-1 تاریخچه کشت و تولید گلرنگ      7

2-2 خاستگاه و ژنتیک گلرنگ      8

2-3  طبقه بندی و سیتوژنتیک گلرنگ      9

2-4 مصارف گلرنگ      10

2-5  تنوع ژنتیکی و اهمیت آن   11

2-6     تنوع ژنتیکی در مقابل تنوع جغرافیایی   12

2-7      اهمیت ایران از نظر منابع ژنتیکی   13

2-8   بررسی تنوع ژنتیکی   13

2-9     روش های آماری بررسی تنوع ژنتیکی   14

2-10 تجزیه کلاستر. 15

2-11 تجزیه به مولفه  های اصلی   15

2-12   معیار های فاصله یا شباهت ژنتیکی   16

2-13      روش های برآورد تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها 16

2-14  نشانگر مولکولی ISSR.. 21

2-15      روش های تجزیه و تحلیل داده های مولکولی برای مطالعه روابط تکاملی   24

های برترقبل از انجام آزمایشات مزرعه ای مورد ارزیابی قرار گیرد و ارتباط بین هتروزیس و فاصله ژنتیكی بر اساس ماركرهای مولکولی ISSRارزیابی گردد.همچنین ترکیب پذیری عمومی و خصوصی والدین و نحوه کنترل ژنتیکی صفات مورد بررسی قرار گرفت . میزان GCA وSCA برای تمامی صفات معنی دار و مثبت بود که نشان از اثرات توام افزایشی و غیر افزایشی در کنترل این صفات دارد. نتایج حاصل از آنالیز نشان داد که تمام صفت بیشتر تحت کنترل اثرات فوق غالبیت قرار دارند. تلاقی P1*P2 بیشترین ترکیب پذیری خصوصی برای صفت عملکرد و تعدادطبق در بوته را داشتند. بیشترین میزان هتروزیس برای صفت ارتفاع تا اولین شاخه فرعی (83/0-) بود.بیشترین همبستگی بین میزان هتروزیس و فاصله ژنتیکی بر اساس مارکر های مولکولی ISSR مربوط به صفت عملکرد ( **30 r= )می باشدکه همبستگی قابل قبولی برای این صفت می باشد، اما برای سایر صفات همبستگی معنی داری مشاهده نشد. کلید واژها: گلرنگ،هتروزیس، نشانگر ISSR، دای آلل. فهرست مطالب 1 فصل اول 1 2 فصل دوم 7 2-1 تاریخچه کشت و تولید گلرنگ 7 2-2 خاستگاه و ژنتیک گلرنگ 8 2-3 طبقه بندی و سیتوژنتیک گلرنگ 9 2-4 مصارف گلرنگ 10 2-5 تنوع ژنتیکی و اهمیت آن 11 2-6 تنوع ژنتیکی در مقابل تنوع جغرافیایی 12 2-7 اهمیت ایران از نظر منابع ژنتیکی 13 2-8 بررسی تنوع ژنتیکی 13 2-9 روش های آماری بررسی تنوع ژنتیکی 14 2-10 تجزیه کلاستر. 15 2-11 تجزیه به مولفه های اصلی 15 2-12 معیار های فاصله یا شباهت ژنتیکی 16 2-13 روش های برآورد تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرها 16 2-14 نشانگر مولکولی ISSR.. 21 2-15 روش های تجزیه و تحلیل داده های مولکولی برای مطالعه روابط تکاملی 24 2-16 ارزیابی درخت فیلوژنتیکی 26 2-17 هتروزیس و عوامل موثر در بروز آن 26 2-17-1 فوق غالبیت… 27 2-17-2 غالبیت… 28 2-17-3 اثرات متقابل ژنی.. 28 2-17-4 سایر عوامل موثر در هتروزیس 29 2-18 روش های به نژادی گلرنگ 33 2-19 روشهای تخمین و پیش بینی هتروزیس و قابلیت ترکیب پذیری 34 2-20 کاربرد مارکرهای مورفولوژیکی در تخمین هتروزیس و قابلیت ترکیب پذیری 34 2-21 روشهای بیومتری و طرحهای آزمایشی 35 2-22 روش تلاقی دی آلل.. 36 3 فصل سوم 39 3-1 تهیه مواد گیاهی 39 3-2 آزمایشات مزرعه ای و انجام تلاقی ها 39 3-3 بررسی مولکولی ژنوتیپ های گلرنگ 40 3-3-1 استخراج DNA ژنومی.. 40 3-3-2 اندازه گیری کمیت و کیفیت DNA 40 3-4 آغازگرهای ISSR.. 41 3-5 انجام واکنش PCR.. 42 3-6 الکتروفورز محصول PCR 44 3-7 آنالیز های آماری 44 3-8 آنالیز داده های مولکولی ISSR.. 45 4 فصل چهارم 47 4-1 تعداد روز تا شروع گلدهی 48 4-2 تعداد روز تا متوسط گلدهی 51 4-3 تعداد روز تا پایان گلدهی 52 4-4 ارتفاع تا اولین شاخه فرعی 55 4-5 تعداد شاخه فرعی 57 4-6 تعداد طبق در بوته 58 4-7 ارتفاع کل گیاه. 60 4-8 وزن صد دانه 61 4-9 عملکرد 63 4-10 تجزیه خوشه ای صفات مورفولوژیکو صفات مولکولی 66 4-11کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 1 درصد.. 67 4-12تنوع ژنتیکی ژنوتیپ های گلرنگ با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR 67 4-13 همبستگی بین فاصله ژنتیکی بدست آمده بر اساس داده های مولکولی مارکر های ISSR و میزان هتروزیس برای صفات مورد بررسی………………………………………………………………………. 69 5 فصل پنجم 73 5-1 نتیجه گیری کلی 73 5-2 پیشنهادات : 74 فهرست اشکال: شکل ‏4–1: خط رگرسیونWr-Vrبرای صفت تعداد روز تا شروع گلدهی Wr=aVr+b، Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 49 شکل ‏4–2: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفات تعداد روز تا متوسط گلدهی. Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 52 شکل‏4–3:خطرگرسیون Wr-Vr برای صفت تعداد روز تا پایان گلدهی . Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10 می باشند. 53 شکل ‏4–4:خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت فاصله تا اولین شاخه فرعی .Wr=aVr +b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 56 شکل ‏4–5: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت تعداد شاخه فرعی در بوته Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند . 58 شکل ‏4–6: رگرسیون Wr-Vr برای صفت تعداد طبق در گیاه W=aVr + b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 59 شکل ‏4–7: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت ارتفاع گیاه .Wr=aVr +br، Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 61 شکل ‏4–8: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت وزن صد دانه Wr=aVr + b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 62 شکل ‏4–9: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت عملکرد . Wr = aVr + b، Wr(کواریانس نتاج.. 64 شکل ‏4–10: گروه بندی 10 ژنوتیپ والدینی گلرنگ بر اساس صفات مورفولوژیک با استفاده از روش UPGMA (1تا10 به ترتیب والدهایP1 تاP10 )می باشند. 66 شکل ‏4–11: بارگذاری DNA بر روی ژل آگارز یک درصد (ستونها از چپ به راست به ترتیب ژنوتیپ های p1 تا p10 می باشند ). 67 شکل ‏4–12:الگوی تکثیر توسط آغازگر 5′ – (TCC)5 RY-3′ 68 شکل ‏4–13: دندروگرام 10 والد گلرنگ بر اساس فاصله ژنتیکی نی با روش UPGMA با استفاده از داده های مولکولی ISSR . 69 فهرست جداول: جدول ‏3–1:مشخصات آغاز گرهای ISSR مورد استفاده. 42 جدول ‏3–2: اجزاء مخلوط واکنش PCR برای تکثیر آغاز گرهای ISSR.. 43 جدول ‏3–3: برنامه چرخه حرارتی واکنش PCR برای تکثیر توسط آغازگرهای ISSR . 43 جدول ‏4–1 :خلاصه تجزیه واریانس صفات بر اساس روش 2 گریفینگ در تلاقی دای آلل لاین های اینبرد گلرنگ. 50 جدول ‏4–2: مقادیر ترکیب پذیری عمومی لاین های اینبرد گلرنگ برای برخی صفات مورد بررسی با استفاده از تلاقی دای آلل. 54 جدول ‏4–3: برآورد پارامترهای ژنتیکی برخی صفات مورد بررسی در تلاقی دای آلل لاینهای اینبرد گلرنگ 65 جدول ‏4–4: مقدار ماتریس تشابه 10 ژنوتیپ والدی گلرنگ بر اساس مارکر مولکولی ISSR.. 68 جدول ‏4–5: ضرایب همبستگی بین فاصله ژنتیکی حاصل از داده های مولکولی ISSR با میزان HPH و HMP برای صفات مورد بررسی در نتاج حاصل از تلاقی دای آلل لاینهای اینبرد گلرنگ. 70 جدول ‏4–6: مقدار فاصله ژنتیکی والدین بر اساس داده های مولکولی ISSR و میزان HHP (هتروزیس نسبت به والد برتر) و HMP (هتروزیس نسبت به میانگین والدین ) برای صفت عملکرد در تلاقی های دای آلل لاین های گلرنگ. 71 1 فصل اول مقدمه افزایش نیاز به روغنهای گیاهی و محدود بودن زمین های حاصلخیز ومنابع آب موجب شده استتا گیاهان دانه ای و روغنی با سازگاری بالا همچون گلرنگ (Carthamus tinctorius L.)مورد توجه قرارگیرند.کشت گلرنگ در ایران به عنوان یکی از مراکز عمده کشت وکار این محصول در دنیای قدیم (نولز،1969) همچنان رواج داشته و در حال توسعه می باشد. گلرنگ در گذشته بیشتر به منظور تهیه رنگدانه قرمز برای استفاده در صنایع رنگرزی و همچنین برای رنگ اغذیه کشت می شد و زراعت آن به منظور استحصال روغن خوراکی از سال 1336 در ایران آغاز گردید (زینعلی، 1378).تولید گلرنگ در ایران با متوسط 700 کیلوگرم در هکتار با متوسط جهانی آن (2000 کیلوگرم در هکتار) فاصله زیادی دارد(زینعلی ،1378).افزایش تولید گلرنگ و توانایی رقابت آن با سایر دانه های روغنی در ایران نیازمند اصلاح ارقامی با عملکرد دانه و میزان روغن بالا می باشد. از این رو افزایش عملکرد و میزان روغن دانه از اهداف مهم اصلاحی این گیاه به شمار می روند. افزایش عملکرد در واحد سطح که مهمترین راه نجات بشر از فقر و گرسنگی استعمدتاً متکی بر اصلاح و ایجاد ارقام پر محصول با خصوصیات و پتانسیل های کمی و کیفی بالا می باشد و تنوع ژنتیکی اساس و پایه کار اصلاح نباتات است.یک اصلاح گر در صورتی می تواند در برنامه های اصلاحی خود موفق باشدکه شانس انتخاب مواد مناسب و تنوع برای او وجود داشته باشد.گاهی انتقال حتییک ژن مفید و با ارزش ازمنابع بومی و یا خویشاوندان وحشی آنها چه از طریق روشهای معمول اصلاح نباتات و چه از طریق تکنیک های پیشرفته مهندسی ژنتیک می تواند تحول عظیم و غیر قابل تصوری در سرنوشت و تولید آن محصول در یک کشور ویا مناطق وسیعی از جهان ایجاد کند.این ژنها عمدتاً در ارقام بومی و خویشاوندان وحشی آنها طی قرن های متمادی بوجود آمده استکه می تواند در بهبود گیاه مورد استفاده قرار بگیرد (فرشاد فر،1377). ایران و برخی ازکشورهای منطقه از جمله افقانستان، پاکستان… خاستگاه و مبداء بسیاری از گونه های گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آنها محسوب شده و از تنوع ژنتیکی بسیار بالایی بر خوردار هستند.گیاه شناسان ایران معتقدند که حدود 12-10 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که این تنوع بیش از تنوع گیاهی در قاره اروپا است. این موضوع عمدتاً به دلیل وسعت، تنوع آب و هوایی و جغرافیایی کشور است.اما به دلیل عوامل نا مساعد محیطی،چرا و بهره برداری بی رویه دام،توسعه صنعتی،کشاورزی مدرن و غیره،این ثروت عظیم و با ارزش خدادادی در حال فرسایش شدید و نابودی است (وجدانی،1375). یکی از نتایج اجتناب ناپذیرکشاورزی مدرن که مبتنی بر استفاده از واریته های اصلاحی با حداکثر عملکرد و کیفیت قابل قبول می باشدکاهش تنوع ذخایر ژنتیکی است.اگر چه تخمین این کاهش تنوع ژنتیکی مشکل و یا غیر ممکن می نماید اما در این که تعداد بسیاری از ژنها ی مفید از دست رفته اند و ذخایر ژنتیکی با سرعت فزاینده ای در حال کاهش است و محصولات زراعی عمده در معرض تهدید روز افزون شرایط محیطی نا مناسب و تنش های زیستی و غیر زیستی قرار گرفته اندتردیدی نیست بنابراین امروزه آگاهی از منابع تنوع ژنتیکی و مدیریت آنها به عنوان اجزای مهم برنامه ها و طرح های اصلاح نباتات تلقی می شوند(قره یاضی،1385). گلرنگ از قدیمی ترین گیاهان شناخته شده نزد انسان استکه از قدیم بعنوان یک گیاه دارویی مورد کشت قرار می گرفته است ودانه گلرنگ دارای 50-30 درصد روغن و 25-15 درصد پروتئین است.روغن گلرنگ فاقد کلسترول بوده واز نظر کیفیت تغذیه ای تقریبا مشابه زیتون است (داجو و ماندل،1996). از آنجایی که تاکنون گلرنگ جزو گیاهان زراعی مهم دنیا محسوب نمی شده است منابع و اطلاعات موجود در ارتباط با آن زیاد نیست.این گیاه در هند و مکزیک در حال حاضر دارای اهمیت زیادی است (داجوو ماندل،1996 و سنگام و همکاران،2005). در بین گیاهان روغنی متداول در دنیا گلرنگ تنها گیاه بومی کشور می باشد و ایران به عنوان یکی از مراکز اولیه پیدایش شناخته شده است (ویس،2009). لذا بدیهی است که در خصوص این گیاه کشور ایران از ذخیره ژرم پلاسم قوی و غنی برخوردار باشد.بنابراین شناخت خصوصیات توده های گلرنگ و امکان بهره گیری بهتر و بیشتر از این منابع متنوع ژنی در برنامه های اصلاحی از اهمیت زیادی بر خوردار است. اولین گام در اصلاح گلرنگ داشتن جمعیتی با تنوع بالا است تا بتوان از داخل آن انتخاب مناسبی انجام داد.برای تولید هیبرید و استفاده از پدیده هتروزیس انتخاب والدین اولیه از اهمیت ویژه ای برخوردار است.وجود فاصله ژنتیکی مناسب بین ارقام از جمله عواملی استکه می تواند ما را در این امر کمک کند.زیرا برای صفات کمی هرچه فاصله ژنتیکی بین والدین از یکدیگر بیشتر باشد نتاج حاصل از تلاقی متنوع تر خواهند بود و احتمال مشاهده نتاج برتر از والدین بیشتر خواهد بود.بنابراین شناخت اجزایی از گیاه که نقش عمده ای در تولید عملکرد نهایی دارند و ارتباط بین آنها و میزان وراثت پذیری صفات از جمله مواردی هستند که در اصلاح این گیاه مانند سایر گیاهان باید مورد توجه قرار بگیرد (ارزانی،1383). با توجه به تنوع ژنتیكی قابل توجه برای این گیاه در ایران اطلاع از نحوه كنترل ژنتیكی صفات و میزان هتروزیس، اصلاح گر را در تعیین بهترین روش اصلاحی كه دارای بیشترین بازدهی باشد یاری می نماید. یكی از مباحث بسیار با اهمیت در طول دوره اصلاح نباتات كشف پدیده هتروزیس میباشد كه امروزه از دیدگاه اصلاح كنندگان نبات به صورت یك پدیده بیولوژیك و به صورت برتری نتاج نسبت به میانگین والدین و یا والدبرتر تعریف می شود (لامکی،1993 ). از آنجایی که هتروزیس با اثرات متقابل آللهای مختلف در یک مکان ژنی ارتباط دارد،استفاده از اختلاف ژنتیکی بر اساس مارکر مولکولی جهت گزینش والدین در پروژه های اصلاحی پیشنهادشده است (سرنا،1997).گزینش لاینهای مناسب جهت تلاقی و شناسایی تلاقی های با عملكرد بالایکی از وقت گیرترین و پر هزینه ترین مراحل در پروژه های اصلاحی هیبرید ها می باشد (ملچینجر،1990). در طول دو دهه گذشته تعداد قابل توجهی از مطالعات وجود همبستگی بین فاصله ژنتیكی بر اساس ماركرهای ملكولی( AFLP،RAPD،SSR,RFLP)یا آیزوزایم ها را با كارایی هیبرید ها و هتروزیس تایید كرده است (پالز،1996). در این مطالعه سعی خواهد شد با مقایسه روشهای كلاسیك تخمین

2-16 ارزیابی درخت فیلوژنتیکی   26

2-17    هتروزیس و عوامل موثر در بروز آن   26

2-17-1 فوق غالبیت… 27

2-17-2 غالبیت… 28

2-17-3 اثرات متقابل ژنی.. 28

2-17-4 سایر عوامل موثر در هتروزیس     29

2-18 روش های به نژادی گلرنگ      33

2-19   روشهای تخمین و پیش بینی هتروزیس و قابلیت ترکیب پذیری   34

2-20      کاربرد مارکرهای مورفولوژیکی در تخمین هتروزیس و قابلیت ترکیب پذیری   34

2-21   روشهای بیومتری و طرحهای آزمایشی   35

2-22 روش تلاقی دی آلل.. 36

3    فصل سوم   39

3-1 تهیه مواد گیاهی   39

3-2    آزمایشات مزرعه ای و انجام تلاقی ها 39

3-3    بررسی مولکولی ژنوتیپ های گلرنگ      40

3-3-1  استخراج DNA ژنومی.. 40

3-3-2 اندازه گیری کمیت و کیفیت DNA   40

3-4 آغازگرهای ISSR.. 41

3-5  انجام واکنش PCR.. 42

3-6  الکتروفورز محصول PCR   44

3-7 آنالیز های آماری   44

3-8 آنالیز داده های مولکولی ISSR.. 45

4     فصل چهارم   47

4-1  تعداد روز تا شروع گلدهی   48

4-2 تعداد روز تا متوسط گلدهی   51

4-3 تعداد روز تا پایان گلدهی   52

4-4   ارتفاع تا اولین شاخه فرعی   55

4-5 تعداد شاخه فرعی   57

4-6  تعداد طبق در بوته  58

4-7 ارتفاع کل گیاه. 60

4-8  وزن صد دانه  61

4-9 عملکرد  63

4-10    تجزیه خوشه ای صفات مورفولوژیکو صفات مولکولی   66

4-11کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل آگارز 1 درصد.. 67

4-12تنوع ژنتیکی ژنوتیپ های گلرنگ با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR   67

4-13 همبستگی بین فاصله ژنتیکی بدست آمده بر اساس داده های مولکولی مارکر های ISSR  و میزان هتروزیس برای صفات مورد بررسی………………………………………………………………………. 69

5   فصل پنجم   73

5-1 نتیجه گیری کلی   73

5-2 پیشنهادات : 74

فهرست اشکال:

شکل  ‏4–1: خط رگرسیونWr-Vrبرای صفت تعداد روز تا شروع گلدهی Wr=aVr+b، Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 49

شکل  ‏4–2: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفات تعداد روز تا متوسط گلدهی. Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا  P10می باشند. 52

شکل‏4–3:خطرگرسیون Wr-Vr برای صفت تعداد روز تا پایان گلدهی . Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10 می باشند. 53

شکل  ‏4–4:خط رگرسیون Wr-Vr  برای صفت فاصله تا اولین شاخه فرعی .Wr=aVr +b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 56

شکل  ‏4–5: خط رگرسیون Wr-Vr  برای صفت تعداد شاخه فرعی در بوته Wr=aVr+b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند . 58

شکل  ‏4–6: رگرسیون Wr-Vr  برای صفت تعداد طبق در گیاه W=aVr + b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 59

شکل  ‏4–7: خط رگرسیون Wr-Vr برای صفت ارتفاع گیاه .Wr=aVr +br، Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 61

شکل  ‏4–8: خط رگرسیون Wr-Vr  برای صفت وزن صد دانه Wr=aVr + b،Wr(کواریانس نتاج –والد) ،Vr (واریانس والدین )، نقاط ژنوتیپ های P1تا P10می باشند. 62

شکل  ‏4–9: خط رگرسیون Wr-Vr  برای صفت عملکرد . Wr = aVr + b، Wr(کواریانس نتاج.. 64

شکل  ‏4–10: گروه بندی 10 ژنوتیپ والدینی گلرنگ بر اساس صفات مورفولوژیک با استفاده از روش UPGMA (1تا10 به ترتیب والدهایP1 تاP10  )می باشند. 66

شکل ‏4–11: بارگذاری DNA بر روی ژل آگارز یک درصد (ستونها از چپ به راست به ترتیب ژنوتیپ های p1 تا p10 می باشند ). 67

شکل  ‏4–12:الگوی تکثیر توسط آغازگر 5′ – (TCC)5 RY-3′ 68

شکل  ‏4–13: دندروگرام  10 والد گلرنگ بر اساس فاصله ژنتیکی نی با روش UPGMA با استفاده از داده های مولکولی ISSR . 69

 فهرست جداول:

جدول ‏3–1:مشخصات آغاز گرهای ISSR مورد استفاده. 42

جدول ‏3–2:  اجزاء مخلوط واکنش PCR برای تکثیر آغاز گرهای ISSR.. 43

جدول ‏3–3: برنامه چرخه حرارتی واکنش PCR  برای تکثیر توسط آغازگرهای ISSR . 43

جدول ‏4–1 :خلاصه تجزیه واریانس صفات بر اساس روش 2 گریفینگ در تلاقی دای آلل لاین های اینبرد گلرنگ. 50

جدول ‏4–2: مقادیر ترکیب پذیری عمومی لاین های اینبرد گلرنگ برای برخی صفات مورد بررسی با استفاده از تلاقی دای آلل. 54

جدول ‏4–3: برآورد پارامترهای ژنتیکی برخی صفات مورد بررسی در تلاقی دای آلل لاینهای اینبرد گلرنگ     65

جدول ‏4–4:   مقدار ماتریس تشابه 10 ژنوتیپ والدی گلرنگ بر اساس مارکر مولکولی ISSR.. 68

جدول ‏4–5: ضرایب همبستگی بین فاصله ژنتیکی حاصل از داده های مولکولی ISSR  با میزان HPH و HMP برای صفات مورد بررسی در نتاج حاصل از تلاقی دای آلل لاینهای اینبرد گلرنگ. 70

جدول ‏4–6: مقدار  فاصله ژنتیکی والدین بر اساس داده های مولکولی ISSR  و میزان HHP (هتروزیس نسبت به والد برتر) و HMP (هتروزیس نسبت به میانگین والدین ) برای صفت عملکرد  در تلاقی های دای آلل لاین های گلرنگ. 71

1    فصل اول
 مقدمه

 افزایش نیاز به روغنهای گیاهی و محدود بودن زمین های حاصلخیز ومنابع آب موجب شده استتا گیاهان دانه ای و روغنی با سازگاری بالا همچون گلرنگ  (Carthamus tinctorius L.)مورد توجه قرارگیرند.کشت گلرنگ در ایران به عنوان یکی از مراکز عمده کشت وکار این محصول در دنیای قدیم (نولز،1969) همچنان رواج داشته و در حال توسعه می باشد. گلرنگ در گذشته بیشتر به منظور تهیه رنگدانه قرمز برای استفاده در صنایع رنگرزی و همچنین برای رنگ اغذیه کشت می شد و زراعت آن به منظور استحصال روغن خوراکی از سال 1336 در ایران آغاز گردید (زینعلی، 1378).تولید گلرنگ در ایران با متوسط 700 کیلوگرم در هکتار با متوسط جهانی آن (2000 کیلوگرم در هکتار) فاصله زیادی دارد(زینعلی ،1378).افزایش تولید گلرنگ و توانایی رقابت آن با سایر دانه های روغنی در ایران نیازمند اصلاح ارقامی با عملکرد دانه و میزان روغن بالا می باشد. از این رو افزایش عملکرد و میزان روغن دانه از اهداف مهم اصلاحی این گیاه به شمار می روند.

افزایش عملکرد در واحد سطح که مهمترین راه نجات بشر از فقر و گرسنگی استعمدتاً متکی بر اصلاح و ایجاد ارقام پر محصول با خصوصیات و پتانسیل های کمی و کیفی بالا می باشد و تنوع ژنتیکی اساس و پایه کار اصلاح نباتات است.یک اصلاح گر در صورتی می تواند در برنامه های اصلاحی خود موفق باشدکه شانس انتخاب مواد مناسب و تنوع برای او وجود داشته باشد.گاهی انتقال حتییک ژن مفید و با ارزش ازمنابع بومی و یا خویشاوندان وحشی آنها چه از طریق روشهای معمول اصلاح نباتات و چه از طریق تکنیک های پیشرفته مهندسی ژنتیک می تواند تحول عظیم و غیر قابل تصوری در سرنوشت و تولید آن محصول در یک کشور ویا مناطق وسیعی از جهان ایجاد کند.این ژنها عمدتاً در ارقام بومی و خویشاوندان وحشی آنها طی قرن های متمادی بوجود آمده استکه می تواند در بهبود گیاه مورد استفاده قرار بگیرد (فرشاد فر،1377).

ایران و برخی ازکشورهای منطقه از جمله افقانستان، پاکستان… خاستگاه و مبداء بسیاری از گونه های گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آنها محسوب شده و از تنوع ژنتیکی بسیار بالایی بر خوردار هستند.گیاه شناسان ایران معتقدند که حدود 12-10 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که این تنوع بیش از تنوع گیاهی در قاره اروپا است. این موضوع عمدتاً به دلیل وسعت، تنوع آب و هوایی و جغرافیایی کشور است.اما به دلیل عوامل نا مساعد محیطی،چرا و بهره برداری بی رویه دام،توسعه صنعتی،کشاورزی مدرن و غیره،این ثروت عظیم و با ارزش خدادادی در حال فرسایش شدید و نابودی است (وجدانی،1375).

یکی از نتایج اجتناب ناپذیرکشاورزی مدرن که مبتنی بر استفاده از واریته های اصلاحی با حداکثر عملکرد و کیفیت قابل قبول می باشدکاهش تنوع ذخایر ژنتیکی است.اگر چه تخمین این کاهش تنوع ژنتیکی مشکل و یا غیر ممکن می نماید اما در این که تعداد بسیاری از ژنها ی مفید از دست رفته اند و ذخایر ژنتیکی با سرعت فزاینده ای در حال کاهش است و محصولات زراعی عمده در معرض تهدید روز افزون شرایط محیطی نا مناسب و تنش های زیستی و غیر زیستی قرار گرفته اندتردیدی نیست بنابراین امروزه آگاهی از منابع تنوع ژنتیکی و مدیریت آنها به عنوان اجزای مهم برنامه ها و طرح های اصلاح نباتات تلقی می شوند(قره یاضی،1385).

گلرنگ از قدیمی ترین گیاهان شناخته شده نزد انسان استکه از قدیم بعنوان یک گیاه دارویی مورد کشت قرار می گرفته است ودانه گلرنگ دارای 50-30 درصد روغن و 25-15 درصد پروتئین است.روغن گلرنگ فاقد کلسترول بوده واز نظر کیفیت تغذیه ای تقریبا مشابه زیتون است (داجو و ماندل،1996). از آنجایی که تاکنون گلرنگ جزو گیاهان زراعی مهم دنیا محسوب نمی شده است منابع و اطلاعات موجود در ارتباط با آن زیاد نیست.این گیاه در هند و مکزیک در حال حاضر دارای اهمیت زیادی است (داجوو ماندل،1996 و سنگام و همکاران،2005).

در بین گیاهان روغنی متداول در دنیا گلرنگ تنها گیاه بومی کشور می باشد و ایران به عنوان یکی از مراکز اولیه پیدایش شناخته شده است (ویس،2009). لذا بدیهی است که در خصوص این گیاه کشور ایران از ذخیره ژرم پلاسم قوی و غنی برخوردار باشد.بنابراین شناخت خصوصیات توده های گلرنگ و امکان بهره گیری بهتر و بیشتر از این منابع متنوع ژنی در برنامه های اصلاحی از اهمیت زیادی بر خوردار است.

اولین گام در اصلاح گلرنگ داشتن جمعیتی با تنوع بالا است تا بتوان از داخل آن انتخاب مناسبی انجام داد.برای تولید هیبرید و استفاده از پدیده هتروزیس انتخاب والدین اولیه از اهمیت ویژه ای برخوردار است.وجود فاصله ژنتیکی مناسب بین ارقام از جمله عواملی استکه می تواند ما را در این امر کمک کند.زیرا برای صفات کمی هرچه فاصله ژنتیکی بین والدین از یکدیگر بیشتر باشد نتاج حاصل از تلاقی متنوع تر خواهند بود و احتمال مشاهده نتاج برتر از والدین بیشتر خواهد بود.بنابراین شناخت اجزایی از گیاه که نقش عمده ای در تولید عملکرد نهایی دارند و ارتباط بین آنها و میزان وراثت پذیری صفات از جمله مواردی هستند که در اصلاح این گیاه مانند سایر گیاهان باید مورد توجه قرار بگیرد (ارزانی،1383).

با توجه به تنوع ژنتیكی قابل توجه برای این گیاه در ایران اطلاع از نحوه كنترل ژنتیكی صفات و میزان هتروزیس، اصلاح گر را در تعیین بهترین روش اصلاحی كه دارای بیشترین بازدهی باشد یاری می نماید. یكی از مباحث بسیار با اهمیت در طول دوره اصلاح نباتات كشف پدیده هتروزیس میباشد كه امروزه از دیدگاه اصلاح كنندگان نبات به صورت یك پدیده بیولوژیك و به صورت برتری نتاج نسبت به میانگین والدین و یا والدبرتر تعریف می شود (لامکی،1993 ). از آنجایی که هتروزیس با اثرات متقابل آللهای مختلف در یک مکان ژنی ارتباط دارد،استفاده از اختلاف ژنتیکی بر اساس مارکر مولکولی جهت گزینش والدین در پروژه های اصلاحی پیشنهادشده است (سرنا،1997).گزینش لاینهای مناسب جهت تلاقی و شناسایی تلاقی های با عملكرد بالایکی از  وقت گیرترین و پر هزینه ترین مراحل در پروژه های اصلاحی هیبرید ها می باشد (ملچینجر،1990). در طول دو دهه گذشته تعداد قابل توجهی از مطالعات وجود همبستگی بین فاصله ژنتیكی بر اساس ماركرهای ملكولی(  AFLP،RAPD،SSR,RFLP)یا آیزوزایم ها را با كارایی هیبرید ها و هتروزیس تایید كرده است (پالز،1996). در این مطالعه سعی خواهد شد با مقایسه روشهای كلاسیك تخمین

 و سوء نیت خاص عبارت است از خواست مجرم به تحقق نتیجه مجرمانه یعنى بردن اطلاعات دیگرى. انگیزه نیز در تحقق این جرم نقشی ندارد و قادر نخواهد بود وصف مجرمانه را از آن بزداید، لیکن ممکن است حسب مورد در تخفیف یا تشدید مجازات موثر باشد.[1]

بنابراین، اگر شخصى اطلاعات دیگرى را غصب کرده باشد و شخص مذکور با ورود به رایانه شخص غاصب، بخواهد اطلاعات خود را تحصیل کند،  چنین شخصى را با توجه به فقدان سوء نیت نمى­توان مرتکب سرقت رایانه دانست. همچنین اگر کسى به قصد تفنن یا شوخى به رایانه دیگرى وارد شود تا اینکه اطلاعات او را بر دارد، با توجه به اینکه مرتکب هنگام ربودن سوء نیت نداشته، عملش منطبق با سرقت نیست. نیز اگر شخصى برنامه­اى را طراحى کند تا به وسیله آن اطلاعات دیگرى را در زمانى برباید و آن را در حافظه رایانه نگهدارى کند، ولى برنامه مذکور به طور اتوماتیک به رایانه دیگر نفوذ کند و اطلاعات را بردارد، عمل مرتکب را نمى­توان سرقت دانست، زیرا در زمان ربودن اطلاعات توسط برنامه، مرتکب قصد و سوء نیتى نداشته است. حال اگر قصد طراح این باشد که برنامه خود به خود و به طور خودکار براى بردن اطلاعات فعال شود، شکى در سارق دانستن چنین فردى وجود ندارد.

و سوء نیت خاص عبارت است از خواست مجرم به تحقق نتیجه مجرمانه یعنى بردن اطلاعات دیگرى. انگیزه نیز در تحقق این جرم نقشی ندارد و قادر نخواهد بود وصف مجرمانه را از آن بزداید، لیکن ممکن است حسب مورد در تخفیف یا تشدید مجازات موثر باشد.[1] بنابراین، اگر شخصى اطلاعات دیگرى را غصب کرده باشد و شخص مذکور با ورود به رایانه شخص غاصب، بخواهد اطلاعات خود را تحصیل کند، چنین شخصى را با توجه به فقدان سوء نیت نمى­توان مرتکب سرقت رایانه دانست. همچنین اگر کسى به قصد تفنن یا شوخى به رایانه دیگرى وارد شود تا اینکه اطلاعات او را بر دارد، با توجه به اینکه مرتکب هنگام ربودن سوء نیت نداشته، عملش منطبق با سرقت نیست. نیز اگر شخصى برنامه­اى را طراحى کند تا به وسیله آن اطلاعات دیگرى را در زمانى برباید و آن را در حافظه رایانه نگهدارى کند، ولى برنامه مذکور به طور اتوماتیک به رایانه دیگر نفوذ کند و اطلاعات را بردارد، عمل مرتکب را نمى­توان سرقت دانست، زیرا در زمان ربودن اطلاعات توسط برنامه، مرتکب قصد و سوء نیتى نداشته است. حال اگر قصد طراح این باشد که برنامه خود به خود و به طور خودکار براى بردن اطلاعات فعال شود، شکى در سارق دانستن چنین فردى وجود ندارد. 3-2-3-2- رکن معنوی سرقت سنتی جرم سرقت علاوه بر عنصر قانونی و مادی باید دارای عنصر روانی باشد، تا تحقق یابد زیرا تنها ارتکاب جرم موجب مسئولیت کیفری نخواهد بود بلکه ارتکاب جرم اولاً باید توأم با اراده و میل، رغبت فاعل باشد. ثانیاً فاعل جرم آن را با سوء نیت انجام داده باشد. پس مرتکب باید به جرم ربودن عمل خود واقف باشد و عالماً مرتکب آن شود و با خواست و اراده قلبی و سوء نیت اقدام به سرقت نماید تا جرم تحقق یابد و مسئولیت کیفری بر عمل فاعل بار شود. پس هر گاه فاعل به اشتباه و به گمان آنکه مال خود را بر می­دارد مال دیگری را تصاحب کند جرم سرقت تحقق نیافته چرا که سوء نیت و عنصر روانی در این مورد وجودنداشته است.[2] 3-3- مجازات سرقت رایانه­ای و سرقت سنتی واکنش رسمی (حقوقی) جامعه در مقابل پدیده مجرمانه در بیشتر موارد به صورت مجازات و در پاره‌ای از موارد به همراه اقدامات تأمینی و تربیتی تظاهر پیدا می­کند این واکنش در قالب «تعقیب جزایی» به اجرا در می‌آید. در مورد سرقت مجازاتها با توجه به نوع آن فرق می­کند، برخی مشمول تعزیر و برخی حد اعمال می­شود.

 3-2-3-2- رکن معنوی سرقت سنتی

جرم سرقت علاوه بر عنصر قانونی و مادی باید دارای عنصر روانی باشد، تا تحقق یابد زیرا تنها ارتکاب جرم موجب مسئولیت کیفری نخواهد بود بلکه ارتکاب جرم اولاً باید توأم با اراده و میل، رغبت فاعل باشد. ثانیاً فاعل جرم آن را با سوء نیت انجام داده باشد.

پس مرتکب باید به جرم ربودن عمل خود واقف باشد و عالماً مرتکب آن شود و با خواست و اراده قلبی و سوء نیت اقدام به سرقت نماید تا جرم تحقق یابد و مسئولیت کیفری بر عمل فاعل بار شود. پس هر گاه فاعل به اشتباه و به گمان آنکه مال خود را بر می­دارد مال دیگری را تصاحب کند جرم سرقت تحقق نیافته چرا که سوء نیت و عنصر روانی در این مورد وجودنداشته است.[2]

3-3- مجازات سرقت رایانه­ای و سرقت سنتی

واکنش رسمی (حقوقی) جامعه در مقابل پدیده مجرمانه در بیشتر موارد به صورت مجازات و در پاره‌ای از موارد به همراه اقدامات تأمینی و تربیتی تظاهر پیدا می­کند این واکنش در قالب «تعقیب جزایی» به اجرا در می‌آید. در مورد سرقت مجازاتها با توجه به نوع آن فرق می­کند، برخی مشمول تعزیر و برخی حد اعمال می­شود.

دانشکده تحصیلات تکمیلی
سمینار برای دریافت درجه کارشناسی ارشد
مهندسی شیمی – فرآیند
عنوان:
بررسی پدیده های انتقال در شرائط خلاء
برای رعایت حریم خصوصی اسامی استاد راهنما،استاد مشاور و نگارنده درج نمی شود
تکه هایی از متن به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده:
در مجموعه صنایع شیمی ما با تعداد زیادی فرآیندها روبرو هستیم که یا در شرایط خلاء انجام می شود و یا سیستم های خلاء در آنها به نحوی کاربرد دارد اما متاسفانه در بین مهندسین شیمی کمتر آشنایی تخصصی با این تکنولوژی پرکاربرد وجود دارد. برای مطالعه پدیده های انتقال (انتقال مومنتم، حرارت و جرم) در سیستم های خلاء، اطلاع از قوانین گازها، رژیم جریان گازها در شرایط خلاء و آشنایی با برخی مفاهیم ضروری می باشد. واژه خلاء معمولا به قسمتی از فضا گفته می شود که فشار آن به مراتب کمتر از یک اتمسفر باشد. و به طور کلی منظور شرایطی است که فشار گاز در آن زیر فشار اتمسفری باشد.
ایجاد خلاء مستلزم دو فرآیند است اول تخلیه گازی که در آغاز در حجم محفظه کار وجود داش دانشکده تحصیلات تکمیلی سمینار برای دریافت درجه کارشناسی ارشد مهندسی شیمی – فرآیند عنوان: بررسی پدیده های انتقال در شرائط خلاء برای رعایت حریم خصوصی اسامی استاد راهنما،استاد مشاور و نگارنده درج نمی شود تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است) چکیده: در مجموعه صنایع شیمی ما با تعداد زیادی فرآیندها روبرو هستیم که یا در شرایط خلاء انجام می شود و یا سیستم های خلاء در آنها به نحوی کاربرد دارد اما متاسفانه در بین مهندسین شیمی کمتر آشنایی تخصصی با این تکنولوژی پرکاربرد وجود دارد. برای مطالعه پدیده های انتقال (انتقال مومنتم، حرارت و جرم) در سیستم های خلاء، اطلاع از قوانین گازها، رژیم جریان گازها در شرایط خلاء و آشنایی با برخی مفاهیم ضروری می باشد. واژه خلاء معمولا به قسمتی از فضا گفته می شود که فشار آن به مراتب کمتر از یک اتمسفر باشد. و به طور کلی منظور شرایطی است که فشار گاز در آن زیر فشار اتمسفری باشد. ایجاد خلاء مستلزم دو فرآیند است اول تخلیه گازی که در آغاز در حجم محفظه کار وجود داشته و دوم سازگاری بین گنجایش پمپ و تولید گازی که از اول در فاز گازی نبوده است بلکه از درزها نشت کرده است، که دومین گازی است که از جداره ها و مواد موجود در محفظه آزاد می شود. جهت انجام یک طراحی نیازمند دانستن سرعت پمپ خلاء جهت تهیه و خرید پمپ و مدت زمانی که لازم است تا سیستم به فشار مورد نظر برسد هستیم که در این فصل به معرفی سرعت گاز و روش ته و دوم سازگاری بین گنجایش پمپ و تولید گازی که از اول در فاز گازی نبوده است بلکه از درزها نشت کرده است، که دومین گازی است که از جداره ها و مواد موجود در محفظه آزاد می شود.
جهت انجام یک طراحی نیازمند دانستن سرعت پمپ خلاء جهت تهیه و خرید پمپ و مدت زمانی که لازم است تا سیستم به فشار مورد نظر برسد هستیم که در این فصل به معرفی سرعت گاز و روش