وبلاگ

1-2 اهداف تحقیق…………………………….. 4

2 بررسی منابع…………………………….. 5

2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا…………………………… 5

2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی…………………… 6

2-2 ایمنوگلوبین Y…………………………….

2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY)……………………. 7

2-2-2 ویژگی‌ها…………………………… 9

2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک……………………………… 9

2-2-4 استفاده در مواد غذائی…………………………….. 10

2-3 هلیکو باکتر پیلوری………………………….11

2-3-1 علائم و نشانه‌ها…………………………… 11

2-3-2 میکروبیولوژی…………………………….. 12

2-3-3 ژنوم……………………………. 13

2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری………………….. 14

2-3-5 نقش CagA در سرطان……………………………. 15

2-3-6 پاتوفیزیولوژی…………………………….. 15

2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم……………………………. 16

2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag……………………………..

2-3-9 سرطان……………………………. 18

2-3-10 آسیب شناسی…………………………….. 19

2-3-11 پیشگیری…………………………….. 19

2-3-12 درمان……………………………. 20

2-3-13 پیش بینی بیماری…………………………….. 21

2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری…………………………….. 22

2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology)………….. 24

2-4 آنتی ژن‌ها……………………………25

2-4-1 ساختمان آنتی ژن……………………………. 25

2-5 اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-1 انواع اپی توپ‌ها…………………………… 26

2-5-2 عملکرد……………………………. 27

2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T……………………………..

2-5-3 واکنش متقاطع……………………………..28

2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی…………………………….. 28

2-5-5 نشانه‌های اپی توپ……………………………… 28

2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه……………………………. 29

2-7 ابزار‌های مورد استفاده…………………………… 38

2-7-1 دات بلاتینگ……………………………… 38

2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5…………………………….

2-7-3 نرم افزار Mega5…………………………….

2-7-4 ابزار BLAST……………………………..

3 مواد و روش‌ها…………………………… 40

3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری…………………………….. 41

3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……41

3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز……………………. 41

3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده…………………………… 42

3-5 طراحی آغازگرها…………………………… 42

3-6 انجام واکنش PCR……………………………..

3-7 خالص سازی محصول PCR……………………………..

3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز……………………………. 45

3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ……………… 45

3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین……………………. 46

3-8-3 محلول غلیظ IPTG  (0. 1M)…………………………….

3-8-4 محلول غلیظ X-Gal  (20mg/ml)…………………………….

3-8-5 محیط کشت LB مایع…………………………….. 46

3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد……………………………. 47

3-9-2 هضم pET-32a  (+)…………………………….

3-9-3 خالص سازی pET-32a  (+) و قطعه هدف………………… 49

3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده…………………………… 50

3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a  (+)………..

3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α……………………………..

3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α……………………………..

3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری…………………………….. 52

3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب………………. 53

3-9-10 کلونی PCR……………………………..

3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب……………………………… 54

3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی………………………. 55

3-10 توالی یابی…………………………….. 56

3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3)……..

3-12 تحریک بیان ژن هدف……………………………… 56

3-13 استخراج پروتئین از باکتری…………………………….. 57

 

3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE……………..

3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد……………..59

3-15 دات بلات……………………………… 61

3-16 محلولها و بافرها…………………………… 62

3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS…………………………….

3-16-2 محلول بلوکه کننده…………………………… 62

3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T……………………………..

3-16-4 آنتیبادی اولیه……………………………. 62

3-16-5 آنتیبادی ثانویه……………………………. 62

3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB…………………..

3-17 خالص سازی پروتئین…………………………….64

3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ………………….. 64

3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی……………… 65

3-19-1 تزریق اولیه…………………………… 65

3-19-2 تزریق‌های ثانویه  (Booster injection)……………………………. 66

3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ……………………………. 66

3-21 جداسازی IgY با استفاده از روش پلی اتیلن گلایکول 14700……………. 66

3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات……………… 67

4 نتایج و بحث……………………………… 67

4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA……………………………..

4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی…………………………….. 69

4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA……………………………..

4-4 بررسی محصولات PCR……………………………..

4-5 خالص سازی محصول PCR……………………………..

4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA……………………………..

4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α……………………………..

4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+)………………………….

4-9 نتایج کلونی PCR…………………………….

4-10 تایید نتایج کلونی PCR با استفاده از T7…………………………….

4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی…………………………….. 75

4-12 توالی یابی…………………………….. 76

4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA……………………………..

4-14 بیان ژن……………………………. 78

4-15 SDS-PAGE…………………………….

4-16 دات بلات……………………………… 79

4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ………… 81

5 نتیجه گیری و پیشنهادات……………………………… 85

چکیده:

هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است.  ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است.  در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با استفاده از هضم آنزیمی به ناقل  pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد.  نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.

فصل اول

1- مقدمه

1-1- اهمیت موضوع

به آنچه که کامل کننده رژیم غذایی مورد نیاز افراد است، “مکمل” گفته می شود.  انرژی مکمل‌ها بر اساس نوع آن‌ها متفاوت است. به طور کلی مکمل‌های غذایی شامل مواد غذایی یعنی کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، چربی‌ها، املاح، مواد معدنی و ویتامین‌ها هستند. از طرفی برخی مواد غذایی هستند که به طور طبیعی دارای اثراتی اثبات شده بر سلامتی می باشند اما مشاهده شده است که برخی مواد غذایی و یا نوشیدنی‌ها دارای اثراتی بر سلامتی هستند که این اثرات را نمی توان به محتوای مواد مغذی  (نظیر درشت مغذی‌ها، ویتامین‌ها و یا مواد معدنی) آن ماده ی غذایی نسبت داد این مواد غذائی غذاهای عمل گرا نامیده می شوند. امروزه مصرف کنندگان در بسیاری از موارد ترجیح می دهند اقلام مورد نیاز خود را از بین غذاهای عمل گرا انتخاب کنند. غذاهای عمل گرا محصولاتی مشتق از مواد غذایی می باشند که علاوه بر ارزش تغذیه ای آن‌ها، موجب ارتقای شرایط طبیعی فیزیولوژیک