وبلاگ

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

چکیده…………………………………………………………………………… 1

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه…………………………………………………………………….. 3

1-2- روابط میكروارگانیسم با ریشه گیاهان…………………………………. 5

1-3- ترشحات ریشه…………………………………………………………… 6

1-4- ریزوسفر…………………………………………………………………… 6

1-4-1 جمعیت میكروبی در ریزوسفر…………………………………………. 7

1-4-2 عوامل مؤثر بر میكروارگانیسم ها در منطقه ریشه…………………. 8

1-5- اهمیت فسفر برای موجودات زنده…………………………………….. 9

1-5-1 اشكال مختلف فسفر در طبیعت……………………………………… 9

1-5-2 تغییر و تبدیلات میكروبی فسفر در طبیعت…………………………. 10

1-5-3 میكروارگانیسم های ریزوسفر و انحلال فسفات…………………… 12

1-5-4 مكانیسم های انحلال فسفر توسط میکروارگانیسم ها………….. 12

1-6- اثر میكروارگانیسم های ریزوسفری بر گیاهان………………………. 14

1-7- کودهای کشاورزی……………………………………………………… 17

1-7-1 مقایسه انواع مختلف کودها………………………………………….17

1-7-2 کود زیستی (Biofertilizer)………………………………………….. 18

1-7-3 دسته بندی کودهای زیستی……………………………………….. 19

1-7-4 اثرات سوء کودهای شیمیایی………………………………………. 19

1-7-5 دلایل اهمیت استفاده از کودهای زیستی…………………………. 20

1-7-5-1 اهمیت کودهای بیولوژیک در سلامتی انسان………………….. 21

1-8- پیشینه استفاده از کودهای زیستی…………………………………. 22

1-9- جایگاه تولید كودهای زیستی در ایران و جهان……………………… 23

1-10- تولید کودهای زیستی………………………………………………. 25

1-10-1 ویژگی ماده حامل………………………………………………….. 26

1-11- کودهای زیستی باکتریایی………………………………………….. 27

1-12- کودهای زیستی فسفاته……………………………………………. 28

1-13- لیگنیت…………………………………………………………………. 29

1-14- ویژگی های گیاه تربچه………………………………………………. 30

1-14-1 خصوصیات گیاه شناسی………………………………………….. 30

1-14-2 شرایط اقلیمی………………………………………………………. 31

1-14-3 کشت تربچه…………………………………………………………. 33

1-15- اهداف تحقیق…………………………………………………………. 34

1-16- فرضیه های تحقیق…………………………………………………… 34

فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق

2-1- پیشینه تحقیق…………………………………………………………. 36

2-2- هدف پژوهش……………………………………………………………. 40

فصل سوم: روش اجرای تحقیق

3-1- تهیه کشت جوان و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده…..42

3-1-1 رنگ آمیزی گرم………………………………………………………… 42

3-1-2 تکنیک کاور اسلیپ……………………………………………………. 42

3-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات در مقیاس آزمایشگاهی…43

3-3- ارزیابی به کارگیری افزودنی­های لازم برای افزایش بقا سویه مورد نظر نسبت به تنش های محیطی مشتمل بر خشکی، شوری، دما، UV، pH

3-3-1 آماده سازی ماده حامل جهت تلقیح با باکتری……………………. 44

3-3-2 اعمال تنش های محیطی بر روی تیمارها………………………… 45

3-3-2-1 محیط کشت استارچ کازئین آگار…………………………………. 46

3-3-2-2 محلول  كدورت سنجی مك فارلند……………………………….. 46

3-3-2-3 محلول رقیق كننده………………………………………………… 47

3-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان ها و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه تربچه…47

3-4-1 روش كشت گلدانی تربچه…………………………………………… 47

3-5- تاثیر سطوح مختلف تلقیح بر روی بقاء در سطح بذر تربچه…………48

3-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه تربچه…48

3-6-1 اندازه گیری غلظت فسفر گیاه تربچه………………………………. 48

3-6-2 روش ساخت معرف وانادات – مولیبدات……………………………. 49

3-6-3 روش تهیه محلول های استاندارد فسفر و رسم منحنی استاندارد…49

3-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف…………………………… 50

3-8- نگهداری سویه مورد نظر برای مطالعات بعدی……………………….50

3-8-1 محیط كشت نوترینت براث (Nutrient Broth)……………………….51

3-8-2 محیط كشت TSA…………………………………………………….

3-9- نتایج آنالیز خاک گلدان قبل از آزمون و پس از آزمون………………..52

3-10-  تجزیه وتحلیل آماری داده ها………………………………………. 52

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ‏ها

4-1- تهیه محیط کشت تازه و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده….54

4-2- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات….54

4-3- تاثیر مواد حامل بر بقاء سویه باکتری……………………………… 55

4-3-1 تاثیر تنش دمایی بر افزایش بقاء باکتری در فرمول……………….55

 

4-3-2 تاثیر تنش شوری بر افزایش بقاء باکتری در فرمول……………….65

4-3-3 تاثیر تنش خشکی بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………….. 73

4-3-4 تاثیر تنش PH بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………………… 76

4-3-5 تاثیر تنش UV بر افزایش بقا باکتری در فرمول…………………… 84

4-4- اعمال بهترین تیمار به گلدان و بررسی پایداری باکتری در ریزوسفر گیاه…89

4-6- تاثیر سطوح مختلف تلقیح به کار برده شده در جذب فسفات توسط گیاه و نتایج آنالیز فسفات خاک گلدان‏ها و آنالیز فسفات گیاه…96

4-7- بررسی بقاء باکتری در حامل‏های مختلف………………………… 103

فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

5-1- نتیجه گیری………………………………………………………….. 111

5-2- پیشنهادات…………………………………………………………… 119

منابع و مآخذ……………………………………………………………….. 121

فهرست منابع فارسی……………………………………………………. 121

فهرست منابع انگلیسی………………………………………………….. 123

چکیده انگلیسی…………………………………………………………… 126

چکیده:

مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان­ها و دیگر موجودات زنده شده است. به همین علت امروزه استفاده از کودهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. باکتری­های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر می رسند. با توجه به اینکه اغلب خاک های ایران آهکی بوده و در اقلیم‏های خشک و نیمه خشک هستند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمبود مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اغلب محصولات کشاورزی باشد، لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. جهت حداکثر افزایش بقاء باکتری در ماده حامل از سطوح تلقیح مختلفی که شامل لیگنیت و مواد تکمیلی پودر سویا و خاک فسفاته با نسبتهای مشخص بود استفاده شد و این مواد حامل تلقیح شده تحت تنشهای دما، شوری، خشکی، pH و uv قرار گرفتند همچنین کلیه مواد حامل ساخته و تلقیح شده بطور جداگانه در یک بازه زمانی 90 روز از لحاظ بررسی بقاء باکتری سنجیده شدند. بهترین فرمول به دست آمده از تنشها در گلدان به کارگیری شد. همچنین تیمارهای دیگری نیز از لیگنیت با سطوح مختلف ساخته و با باکتری و بذر تربچه تلقیح شد و بقاء باکتری در بازه 24 ساعته اندازه گیری شد و بعد از آن در گلدان به کار گرفته شدند. با توجه به نتایج به دست آمده بهترین فرمول به دست آمده از تنش­ها و بازه زمانی 90 روز، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% تعیین شد و بعد از بکارگیری در گلدان بهترین نتیجه را نسبت به سایر مواد حامل و کنترل نشان داد و پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه را بهتر از تمامی مواد حامل و کنترل افزایش داده است. از بین تیمارهای ساخته شده و تلقیح شده به بذر تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتایج را نشان داد و بعد از به کارگیری تیمارها در گلدان نیز تیمار شامل 200 گرم حامل + خاک مزرعه بهترین نتیجه را نشان داد. این فرمول بهترین نتیجه را در پارامترهای رشد گیاه تربچه و جذب فسفات گیاه نسبت به سایر تیمارها نشان داد. در یک نتیجه گیری کلی، فرمول لیگنیت + خاک فسفات 2% + سویا 1% به عنوان فرمول نهایی و اصلی برای به کارگیری در آزمایشات بعدی و مقیاس مزرعه پیشنهاد می‏گردد.

فصل اول: کلیات تحقیق

1-1- مقدمه

طی چند دهه اخیر به علت افزایش جمعیت و تقاضای روزافزون برای مواد غذایی، مصرف کود های شیمیایی به منظور افزایش مقدار تولید در واحد سطح به شدت افزایش یافته است. استفاده از کودهای شیمیایی فسفاته تاریخچه دیرینه ای دارد و به انقلاب سبز و معرفی کودهای شیمیایی بر می گردد(ساریخانی و همکاران 1389، 13).‏‏‏ مصرف بی رویه کودهای شیمیایی موجب عدم تعادل عناصر و مواد غذایی موجود در خاک، کاهش بازده محصولات کشاورزی و به خطر افتادن سلامت انسان ها و دیگر موجودات زنده خواهد شد. نیاز به جایگزینی مناسب برای کودهای شیمیایی زمانی احساس می شود که بدانیم علاوه بر آسیب های زیست محیطی ناشی از کاربرد کودهای شیمیایی، محدود بودن منابع، افزایش قیمت تمام شده و تثبیت شدن قسمت اعظمی از کودهای فسفاته مصرفی به شکل غیرقابل استفاده برای گیاه نیز پیامدهای استفاده از این کودهای شیمیایی هستند(ساریخانی و همکاران 1389، 13).

ضرورت یافتن جایگزینی مناسب برای رهاسازی فسفات تجمع یافته در خاک زمانی بیشتر احساس می شود که  بر این امر واقف گردیم که منابع فسفات موجود در خاک  قابلیت تامین فسفات مورد نیاز گیاهان برای تولید بهینه تا صد سال را دارا می باشد. بنابراین کافی است که این منبع عظیم فسفر را به صورت قابل جذب و استفاده برای گیاه تبدیل نمود (Bashan 1998, 16). به همین علت امروزه استفاده از کودهای بیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است که مکانیسم عمل آنها قابلیت جذب عناصر غذایی گیاه در خاک را افزایش می‏دهد. باکتری­های حل کننده فسفات برای افزایش فراهمی فسفر مورد نیاز گیاه کارآمد به نظر       می رسند (Bashan 1998, 16). فسفر در خاک‌ها به دو شکل آلی و معدنی  وجود دارد اما غلظت فسفات محلول در خاک معمولاً خیلی پایین است (Bashan 1998, 16). قسمت اعظم میکرو ‏‏ارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در ریزوسفر گیاهان متمرکز شده‌اند. میکروب‏های خاک توانایی تبدیل اشکال نامحلول فسفر به اشکال محلول را دارند. ترکیبات آلی و معدنی خارج شده از ریشه، باعث افزایش جمعیت میکروبی در اطراف ریشه می‌گردند . با توجه به اینکه میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات در خاک به طور طبیعی وجود دارند و موجب افزایش فسفر قابل دسترس و تحریک رشد گیاه می‌شوند، اما تعداد آن‌ها در خاک به اندازه کافی نیست تا با سایر میکروارگانیسم‏هایی که در ریزوسفر قرار دارند رقابت کنند. بنابراین تلقیح گیاهان با میکروارگانیسم‏های محلول کننده فسفات اثرات مفیدی دارد. باکتری­های حل کننده فسفات طی سه مکانیسم تولید اسیدهای آلی، کلات کردن و واکنش های تبادل لیگاند موجب انحلال ترکیبات نامحلول فسفات می‏شوند. طی فرآیند انحلال بخشی از فسفر محلول، توسط باکتری حل کننده فسفات استفاده می‏شود اما از آنجائیکه مقدار فسفر حل شده بیش از نیاز باکتری‏ها است لذا این مقدار آزاد می‏تواند در اختیار گیاه قرار گیرد. اغلب خاک‏های ایران دارای آهک و گچ بوده و این امر می‏تواند موجب تثبیت فسفر شود. در نتیجه فسفر جذب ذرات کلوئیدی خاک شده و از دسترس گیاه خارج می شود. بنابراین در غالب خاک‌ها از نظر مقدار فسفر کل مشکل وجود ندارد، بلکه مشکل، در دسترس قرار گرفتن آن می‌باشد. فسفر جذب عناصری مانند Ca2+، Fe3+  و Al3+ شده و باعث تشکیل ترکیبات نامحلول می‌گردد (Bhattacharyya and Jha 2012, 28).

[1]PGPR یا باکتری های تحریک کننده رشد گیاه، گروهی از باکتری‏های ریزوسفر هستند که به طور مستقیم (انحلال فسفات، تولید هورمون­ها…) و غیر مستقیم (تولید کاتالاز، سیانید هیدروژن و….) موجب افزایش رشد گیاه می شوند. با توجه به طیف گسترده اثرات مثبت برخی از باکتری­های سودمند از قبیل تولید سیدروفور، تولید هورمون­ها و ویژگی بیوکنترلی آنها بر ضد قارچها و عوامل بیماریزا، متمرکز شدن بر تحقیقاتی که منجر به حصول چنین میکروارگانیسم های چند منظوره ای باشد بسیار مثمر ثمر خواهد بود، زیرا کودهای زیستی تلقیحات میکروبی هستند که علاوه بر افزایش جذب عناصر غذایی، موجب افزایش رشد گیاه می‏شوند، بنابراین با کاربرد سویه های PGPR  می‏توان چندین هدف را به طور همزمان دنبال کرد ((Boraste 2009, 1; Saharan and Nehra 2011, 21.

استفاده از ماده حامل مناسب در تولید یک کود زیستی با کیفیت بسیار مهم و ضروری است. ذغال­سنگ نارس[2]، ذغال­سنگ قهوه­ای[3]، چارکل[4]، گل یا لجن فشرده، کودهای مزرعه­ای و مخلوط خاک­ها می­توانند به عنوان یک حامل مناسب استفاده شوند. ذغال سنگ طبیعی و ذغال سنگ قهوه ای حامل­های بهتری برای کودهای زیستی هستند. الحاق میکروارگانیسم به ماده حامل باید به گونه ای باشد که قابل حمل و لمس راحت و تجزیه طولانی باشد و کمترین اثر را روی کود زیستی بگذارد. بر طبق تحقیقات هوبن[5] و سوماسه گاران[6] یک ماده حامل خوب برای تلقیح بذر، باید ارزان و به راحتی در دسترس باشد، علاوه بر این نباید برای سویه های باکتریایی و گیاه سمی باشد زیرا حامل می تواند روی بذر اثر بگذارد. همچنین حامل باید ظرفیت جذب رطوبت خوبی داشته باشد و به خوبی به بذر متصل شود و در نهایت حامل باید ظرفیت بافری و pH مناسبی داشته باشد و به راحتی بتوان آن را با اشعه گاما یا اتوکلاو استریلیزه کرد (Boraste 2009, 1).

باتوجه به اینکه در خاک های آهکی ایران که در اقلیم های خشک و نیمه خشک تحول پیدا کرده اند، وجود pH بالا، درصد زیاد کربنات کلسیم، کمی مواد آلی و خشکی خاک باعث شده اند که جذب فسفر کمتر از مقدار لازم برای تامین رشد بهینه اکثر محصولات کشاورزی باشد. لذا هدف از این پژوهش بررسی تاثیر   spp.  Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد.

2-1- روابط میكروارگانیسم با ریشه گیاهان

میكروارگانیسم های خاك ارتباط های گسترده و متنوعی با ریشه گیاهان عالی دارند كه مهمترین آنها عبارتند از:

1- همزیستی: به شكل ارتباط های میكوریزی و تشکیل گرهک در گیاهان خانواده لگومینوز میباشد.