(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده فارسی…………………………………………………………….. 1
فصل اول: مقدمه
1-1 پروتئین ALCAM. …………………………………………………………………. 3
1-2 سرطان ……………………………………………………………………………. 6
1-3 سرطان کولورکتال……………………………………………………….. 6
1-3-1انواع مختلف سرطان کوورکتال………………………………… 9
1-3-2 علائم شایع سرطان کولورکتال…………………………………….. 9
1-3-3 تعیین مرحله بیماری ………………………………………………… 10
1-3-4 تشخیص سرطان کولورکتال ……………………………… 13
1-3-5 انواع ژنتیکی سرطان کولورکتال و تغییرات مولکولی انها ……………………………………. 15
1-3-6 عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان کولورکتال………………………………………….. 20
1-3-7 درمان های رایج سرطان کولورکتال…………………………………………………………. 21
1-4 مساله تحقیق ……………………………………………………………………………………….. 23
فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده
2-1 ALCAM در درمان سرطان……………………………………. 24
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1 مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………. 27
3-1-1 باکتری مورد استفاده…………………………………………………………………………………………… 27
3-1-2
پلاسمید………………………………………………………………………………………………………………………. 27
3-1-3 انزیم ها……………………………………………………………………………………………………………….. 28
3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………………….. 28
3-1-5 انتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………. 28
3-1-6 محیط کشت ………………………………………………. 28
3-1-7 ژل ………………………………………………………………………. 28
3-1-8 مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………………. 28
3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………………. 28
3-2 انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئینALCAM.. …………………………………………………………………… 34
3-2-1 استخراج توالی مورد نظر………………………………………………………………………………………………….. 34
3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………….. 35
3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………… 35
3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب……………………………………………………………………………………………….. 35
3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده………………………………….. 35
3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه……………………………………………………………………………………. 36
3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیهV پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 36
3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته………………………………………………………………………………………………. 36
3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 36
3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………….. 37
3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10 E.coli…………………………………………………………… 38
3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 38
3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………. 39
3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK حاوی DNA ناحیه Vپروتئین ALCAM………………………………………………… 39
3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………. 41
3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion………………………………………………………………………………… 42
3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………….. 42
3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهV پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………….. 44
3-5-1 تخلیص DNA ناحیه Vاز ژل……………………………………………………………….. 44
3-5-2 ………………………………………………………………………….. 46
3-5-3 ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………………………… 46
3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 47
3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………… 48
3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………. 48
3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ناحیه VپروتئیALCAM……………………………………………………. 49
3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج ……….. 51
3-6 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………….. 52
3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG…………………………………………………………………………. 52
3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page………………………………………………………………. 52
3-6-2-1 محتویات كیت. SDS-page ……………………………………………………………………..53
3-6-2-2روش انجام SDS_page………………………………………………………………… 54
فصل چهارم: نتایج
4-1نتایج حاصل از انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………… 58
4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization…………………………………… 58
4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه …………………………………………… 63
4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSKحاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM……………………………………………………….. 65
4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM………………………………………………………………………………. 66
4-5 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page………………………….. 69
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
بحث……………………………… 71
نتیجه گیری……………… 83
منابع……………………………………… 84
چکیده انگلیسی………………………………..91
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1. نمای شماتیک از ساختار پروتئینALCAM…………………………………………………………………….. 4
2-1 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیاییALCAM در بافت توموری………………………………………………….. 5
شکل 1-3. اناتومی کولون و رکتوم…………………………………………………………………………………….. 7
شکل1-4 مرحله صفر سرطان کولورکتال……………………………………………………………. 10
شکل1-5 مرحلهƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال…………………………………… 11
شکل1-6 مرحلهƖƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال……………………………………. 11
شکل 1-7 مرحلهA]]] از پیشرفت سرطان کولورکتال………………………… 12
شکل1-8. مرحله. B. ƖƖƖاز گسترش سرطان کولورکتال…………………………………….. 12
شکل 1-9 مکانسیم ناپایداری میکروستلایت………………………………………………………… 18
شکل 1-10 تفاوت های پاتولوژی بین تومورهایی که ناپایداری کروموزومی و میکروستلایت…………………………………………………. 19
شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ……………………………………………………………………………….. 29
شکل 3-2.شیکر انکوباتور…………………………………………………………………………………….. 30
شکل 3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 30
شکل 3-4. تانک الکتروفورز (SDS-Page)…………………………………………………………………. 31
شکل 3-5…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………. 31
شکل3-6. سانتریفیوژ اپندورف المان……………………………………………………………………….. 32
شکل 3-7… بن ماری………………………………………………………………………………………………….. 32
شکل 3-8… انکوباتور………………………………………………………………………………………. 33
شکل 3-9 دستگاه تصویرساز ژل………………………………………………………………………….. 33
شکل 3-10 سانتریفوژ یخچال دار. ……………………………………………………………………… 34
شکل 3-11 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز………………………………………………… 39
شکل3-12 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز…………………………………………… 44
شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………. 60
شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی …………………………….. 60
شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………….. 60
شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………… 61
شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………… 63
شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم انزیمی ………………………………………………………….65
شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAناحیهV………………………………………………………………………………. 66
شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهVپروتئینALCAM. …………………………………………………………….. 67
شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK………………………………………………. 67