وبلاگ

استاد مشاور:
دکتررضا نظام زاده
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده درج نمی شود
تکه هایی از متن به عنوان نمونه : (ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده……………………………………………………………………………………………………………………………..2
فصل اول- مقدمه                                                                
   مقدمه وهدف………………………………………………………………………………………………………………..4
فصل دوم-مروری بر تحقیقات گذشته                                          
2-1- خصوصیات سالمونلا……………………………………………………………………………………………..8          
2-1-1- تاریخچه…………………………………………………………………………………………………………….8          
2-1-2- طبقه بندی………………………………………………………………………………………………………….9          
2-1-3- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک………………………………………………………10        
2-1-4- حساسیت به مواد شیمیایی………………………………………………………………………………….12        
2-1-5- ساختار پادگنی سالمونلا……………………………………………………………………………………12        
2-1-6- روش های طبقه بندی……………………………………………………………………………………….14        
2-1-7- شرایط رشد سالمونلا………………………………………………………………………………………..15         
2-1-8- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………..17        
2-1-9- منشا سالمونلا…………………………………………………………………………………………………..20        
2-2- آلودگی در انسان………………………………………………………………………………………………….21        
2-2-1- میزان شیوع سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………22
2-2-2- علائم سالمونلوز در انسان…………………………………………………………………………………23
2-2-3- دوز آلوده کننده……………………………………………………………………………………………….25
2-2-4- پیشگیری………………………………………………………………………………………………………..25
2-3- سالمونلوز در حیوانات…………………………………………………………………………………………26
2-4- سالمونلوز در پرندگان………………………………………………………………………………………….27
2-4-1- آلودگی در طیور………………………………………………………………………………………………27
2-4-2- میزان شیوع…………………………………………………………………………………………………….28
2-5- روش های تشخیص سالمونلا………………………………………………………………………………..29
2-5-1- روش های کشت……………………………………………………………………………………………29
2-5-2- روش سرولوژیکی………………………………………………………………………………………….30
2-5-3- روش الایزا…………………………………………………………………………………………………. 30
2-5-4- روش آگلوتیناسیون به کمک لاتکس………………………………………………………………. 31
2-5-5-1-روشPCR……………………………………………………………………………………………….. 31        
2-5-5-2-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR………………………………………………………………. 31
2-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR………………………………………………………….33
2-5-5-4-   اجزای PCR…………………………………………………………………………………………..33
2-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا……………………………………………………………….34
فصل سوم:مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………….44          
3-1- وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………………………..45
3-2- مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………46
3-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی……………………………………………………………………………46
3-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط…………………………………………………………………46
3-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه……………………………………………………………..46
3-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی…………………………………………………………………………47
3-5- آزمون های بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………47
3-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی…………………………………………………………………..47
3-5-2- آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………… 48        
3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر………………………………………………………………………………….48
3-5-4- آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………..49
3-5-5- آزمون

سیترات………………………………………………………………………………………………49
3-5-6- آزمون حرکت………………………………………………………………………………………………..49
3-6- آزمون رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………………..49
   3-6-1- تهیه گسترش روی لام…………………………………………………………………………………..50
   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله…………………………………………………………………………50
3-6-3- مرحله شستشو……………………………………………………………………………………………..51
   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید…………………………………………………………………………51
   3-6-5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل………………………………………………………51
   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین…………………………………………………………………………………….51
   3-6-7- خشک کردن لام……………………………………………………………………………………………51
 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ………………………51
   3-7- استخراج DNA………………………………………………………………………………………………52                                                                    
3 -7-1-   مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………..52
3-8- آزمون PCR………………………………………………………………………………………………….. 52                                                                                              
3-8-1- مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………….52
3-8-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………53
3-9- الکتروفورز محصولاتPCR………………………………………………………………………………54                                                                  
3-9-1- مواد و وسائل لازم……………………………………………………………………………………….54      
3-9-2- تهیه بافر 1x………………………………………………………………………………………………..55
3-9-3- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………55
3-8-4- بارگذاری محصولات ……………………………….PCR…………………………55              
3-10- مشاهده باند های روی ژل………………………………………………………………………………56                                                      
3-10-1- مواد و وسایل لازم…………………………………………………………………………………….56
فصل چهارم :نتایج                                                                      
4-1 نتایج………………………………………………………………………………………………………………..58
4-2- کشت در محیط جامد انتخابی……………………………………………………………………………58
4-2-1- کشت در محیط XLD ………………………………………………………………………………..58                                                                            
4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار……………………………………………………………….59
4-3-آزمون گرم………………………………………………………………………………………………………..59
4-4-تست های بیو شیمیایی…………………………………………………………………………………………..60
4-4-1-آزمون .TSI……………………………………………………………………………………………………..60
4-4-2-آزمون اوره آز………………………………………………………………………………………………….60
4-4-3-آزمون ..VP…………………………………………………………………………………………………61
4-4-5-آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………….61
4-4-6-آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………… 61
4-4-7-آزمون حرکت…………………………………………………………………………………………………..62
4-5-استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………..63
4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار………………………………………………………………………63
4-6-آزمونPCR…………………………………………………………………………………………………………63
4 -7-نتایج آزمون کای دو……………………………………………………………………………………………67
فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            
5-1- بحث………………………………………………………………………………………………………………..69
5-2- نتیجه گیری نهایی………………………………………………………………………………………………77
5-3-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………….78
چکیده:
عفونت‌های سالمونلایی که عفونت های غذایی نامیده می‌شوند، ممکن است توسط هر یک از سرووارها ایجاد شود. معمولا باکتری عامل عفونت در ماده غذایی رشد می‌کند تا به مقدار قابل توجهی برسد. به این ترتیب احتمال عفونت افزایش یافته و موجب بروز بیماری در خانواده‌ها و گروه‌های بزرگ می‌شوند. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی‌های غذایی انسان و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را داراست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیت در انسان می‌باشند. در این مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بیمارستان‌های شهرستان سبزوار جمع‌آوری گردید و با رعایت کامل موارد بهداشتی به آزمایشگاه تخصصی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار منتقل شدند. برای جداسازی اولیه از محیط کشت‌های بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گردید. جهت تایید تشخیص از تست‌های بیوشیمیایی نظیر TSI و اوره آگار و VP، اندول و سیمون سیترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باکتری سالمونلا با استفاده از روش کشت میکروبی جدا شد. این در حالی است که با استفاده از روش مولکولی Multiplex PCR ، 21 مورد باکتری سالمونلا در نمونه‌ها ردیابی گردید. بنابراین می‌توان گفت که روش PCR نسبت به کشت میکروبی از دقت بالاتری برخوردار است و همچنین روش‌های سنتی کشت میکروبی اغلب زمان‌بر خسته‌کننده و پرهزینه است.
واژه‌های کلیدی: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع
 مقدمه و هدف:
در طول دهه گذشته وقوع بیماری‌ها و عفونت های با منشا غذایی نه تنها در کشورهای در حال توسعه و با فقر بهداشتی، بلکه در کشورهای توسعه یافته و با استانداردهای بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده و این در حالی است که وقوع عفونت‌ها و مسمومیت‌های غذایی اغلب گزارش نشده باقی می‌ماند و لذا تعیین آمار دقیق از میزان ابتلا خصوصاً در کشورهای درحال توسعه امکان‌پذیر نمی‌باشد. غذا می‌تواند به عنوان یک حامل، بسیاری از میکروارگانیسم‌های عامل عفونی یا غیر عفونی را در خود حمل کند که در بعضی از شرایط، رشد عامل عفونی را حمایت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و یا تنها نقش ناقل غیرفعال را ایفا می‌نماید که در این صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و یا تنها به وسیله‌ی غذا به انسان منتقل می‌شود. بیماری‌های غذایی جزء بیماری‌های روده‌ای تقسیم‌بندی می‌شوند که از نظر اهمیت در آمریکا بعد از بیماری‌های ریوی در مقام دوم قرار دارند. در یک بررسی در ایالات متحده گزارش شده که بطور مستقیم هر آمریکایی حداقل هر سال یکبار به بیماری‌های روده‌ای با علامت اسهال مبتلا می‌شوند. گفته می‌شود که این مسئله به خاطر ناسالم بودن غذای تولید شده در این کشور نیست بلکه مردم با عمل‌آوری غلط و غیربهداشتی و یا از طریق انتقال عوامل عفونی خود غذا را ناسالم می‌کنند (مهرور و همکاران،1385).
برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بیش از هزار میلیون مورد اسهال حاد در بین بچه‌های زیر پنج سال در کشورهای آمریکا، آسیا (به استثنای چین) و آمریکای لاتین اتفاق می‌افتد که به مرگ بیش از پنج میلیون نفر منجر می‌گردد. در کشورهای صنعتی مشکل کمتر از این‌هاست ولی به طور معنادار هنوز از اهمیت خاصی برخوردار است. طبق گزارش‌های موجود تنها در یک همه‌گیری آن هم در کشوری مثل آمریکا بیش از 15000 نفر در اثر مصرف شیرآلوده به سالمونلای مقاوم به آنتی‌بیوتیک مبتلا شدند. باکتری‌ها به عنوان مهم‌ترین عوامل در بروز بیماری‌های ناشی از مصرف غذا می‌باشند(اردستانی و همکاران،1386). از جمله این عوامل بیماری‌زا خانواده انتروباکتریاسه است(تاجبخش،1386). خانواده انتروباکتریاسه از تعداد زیادی باکتری گرم منفی تشکیل شده که قرابت بسیاری با هم دارند و در آب و خاک و مواد در حال فساد و گیاهان و دستگاه گوارش انسان و حیوانات و حشرات یافت می‌شوند. از آن جا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. باکتری‌های جنس سالمونلا گرم منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری، باسیلی شکل به اندازه‌ی 5-2 × 5/1 – 7/0 میکرون هستند که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشند (تاجبخش،1376).
از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند. این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است. اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا کرده و بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی ، بیماری‌هایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند(زهرایی صالحی،1388). این باکتری‌ها معمولاً از طریق مدفوع انسان یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردند. انسان و حیوانات در بیشتر موارد در اثر مصرف این‌گونه مواد آلوده، باکتری را وارد دستگاه گوارش خود کرده و در نتیجه این گردش دهانی – مدفوعی تداوم می‌یابد(زهرایی صالحی،1388). باکتری سالمونلا انتریکا مهم‌ترین عامل در ابتلا به بیماری سالمونلوز در انسان می‌باشد به طوری که شیوع عفونت‌های سالمونلا انتریتیدیس به خصوص در دهه‌ی اخیر افزایش یافته است. فرد آلوده با سرووارهای سالمونلا انتریکا اغلب مبتلا به تب، دردهای ماهیچه‌‌های شکمی و اسهال می‌باشد. شروع این علائم از 12 ساعت تا یک هفته پس از مصرف غذای آلوده ادامه دارد. این بیماری اغلب 4 تا 7 روز به طول می‌انجامد در بسیاری از افراد بدون درمان با آنتی‌بیوتیک بهبود می‌یابند. با این حال، اسهال می‌تواند شدید و گاهی اوقات منجر به بستری شدن افراد در بیمارستان گردد. بیماری در شیرخواران، کودکان و همچنین افراد مسن شدت داشته و نگران‌کننده می‌باشد. در مواردی بیماری می‌تواند به مرگ و میر در افراد حساس منجر شود(یوسفی مشعوف و همکاران ،1380) .
امروزه در آزمایشگاه‌های میکروب‌شنای از سه روش رایج جهت شناسایی و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.
1- روش کشت سنتی و بیوشیمیایی که با تهیه نمونه و تهیه محیط کشت و تشخیص باکتری استفاده می‌شود.